前B細(xì)胞增強(qiáng)因子對IL-1β介導(dǎo)的肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和通透性的調(diào)節(jié).pdf

1、前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(Pre-B-cell colony-enhancing factor，PBEF)基因最早是從激活的外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫中克隆獲得。它作為B細(xì)胞早期分化的一種生長因子，可以增強(qiáng)IL-7和干細(xì)胞因子(SCF)促進(jìn)前B細(xì)胞向B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時，PBEF主要分布在胞漿，處于非增殖狀態(tài)時，則主要出現(xiàn)在胞核內(nèi)，從而認(rèn)為PBEF是與細(xì)胞周期有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白。在炎癥細(xì)胞因子如IL-β，TNF-α

2、促使中性粒細(xì)胞生存期延長的過程中，細(xì)胞內(nèi)PBEF表達(dá)明顯增多;通過RNAi技術(shù)抑制PBEF的表達(dá)后，可以完全抵消炎性細(xì)胞因子針對中性粒細(xì)胞的抗凋亡作用。在妊娠過程中，PBEF在胎膜表面大量表達(dá)能使IL-6和IL-8表達(dá)增加，這可能在自然分娩和感染性流產(chǎn)中起了重要的作用。PBEF還具有煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的活性，參與NAD+的生物合成，通過調(diào)節(jié)NAD+依賴蛋白脫乙酰基酶(Sir)-2的活性，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的成熟。最近研究表明，PBEF

3、具有很好的類胰島素活性，可以降低血漿葡萄糖水平，增加機(jī)體對胰島素的敏感性。因此，PBEF是一個具有多種重要生物學(xué)功能的蛋白，在體內(nèi)許多的生理性和病理性過程中發(fā)揮著重要的作用，已成為許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的研究對象。 急性肺損傷(ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭。嚴(yán)重的ALI或ALI的最終嚴(yán)重階段被定義為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。ALI/ARDS主要病理特征為肺微血管通透性增高而導(dǎo)致

4、的肺泡滲出液中富含蛋白質(zhì)的肺水腫及透明膜形成，并伴有肺間質(zhì)纖維化。由肺內(nèi)炎癥細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-8)為主導(dǎo)的肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的肺泡毛細(xì)血管膜損傷是形成肺毛細(xì)血管通透性增高肺水腫的病理基礎(chǔ)。目前ARDS的病死率為50-90％，究其原因，主要是由于ARDS發(fā)病機(jī)理錯綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。 我們以前通過對動物ALI的模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PBEF的基因表達(dá)在血清、支氣管肺泡灌洗液以及肺組

5、織中的表達(dá)明顯增加。通過對人類PBEF基因近端啟動子區(qū)域的單核酸酸多態(tài)性(SNP)分析，我們發(fā)現(xiàn)在SNPT-1001G和C-1543T中GC單倍體ALI的發(fā)病率顯著增加，報告基因分析顯示SNP C-1543T中T的變異可以顯著降低PBEF的轉(zhuǎn)錄。此外，凝血酶所弓l起的PBEF表達(dá)的增加以及內(nèi)皮細(xì)胞屏障的功能障礙，可能是急性肺損傷發(fā)生的重要機(jī)制。綜上，這些研究結(jié)果提示PBEF可能是急性肺損傷一個新的生物學(xué)標(biāo)志物。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕?/p>

6、過研究PBEF在IL-1β介導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的炎癥和通透性中的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討PBEF在ALI發(fā)病中確切的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究了轉(zhuǎn)錄抻制劑對IL-1β刺激后的A549和HPAEC細(xì)胞中PBEF基因mRNA表達(dá)的影響；通過凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)錄因子與PBEF基因啟動子區(qū)域SNP C-1535T的結(jié)合能力；將PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA轉(zhuǎn)染到人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)和人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAEC)

7、中，觀察了PBEF過表達(dá)和PBEF表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞IL-8的分泌以及細(xì)胞通透性的影響；我們還研究了PBEF的表達(dá)對于其它的炎性細(xì)胞因子比如IL-16和CCR3基因表達(dá)的影響。為此做了以下的一些工作： 1．通過蛋白免疫印跡(western blotting)的方法，對IL-1β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中PBEF蛋自表達(dá)的劑量依賴性與時間依賴性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)A549細(xì)胞中PBEF蛋白的表達(dá)呈時間依賴性，并且在5至25n

8、g/ml濃度范圍內(nèi)，IL-1β均可使PBEF蛋白的表達(dá)顯著增加。 2．用轉(zhuǎn)錄抑制劑-放線菌素D處理IL-1β刺激后A549和HPAEC細(xì)胞，通過RT-PCR。半定量的方法分析了轉(zhuǎn)錄抑制劑對PBEF基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，IL-1β可以顯著增加A549和HPAEC細(xì)胞中PBEF基因mRNA的表達(dá)，這在一定程度上是由于IL-1β可以增加PBEF基因的轉(zhuǎn)錄所致。 3．通過凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)錄因子與PBEF基因啟

9、動子區(qū)域SNP C-1535T的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，PBEF基因啟動子區(qū)域C-1535T中T的變異可以改變一個未知的轉(zhuǎn)錄因子與PBEF基因啟動子的親和力，降低PBEF基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少基因的表達(dá)。 4．將PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA轉(zhuǎn)染到A549和HPAEC細(xì)胞中，觀察了PBEF過表達(dá)和PBEF表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞IL-8表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，PBEF過表達(dá)可以顯著增加IL-1β刺激后的A549和HPAEC細(xì)胞中IL

10、-8的分泌；而PBEF的siRNA所引起的PBEF表達(dá)下調(diào)則可以顯著降低IL-1β刺激后的A549和HPAEC細(xì)胞中IL-8的分泌。這些結(jié)果表明PBEF作為IL-1β所引發(fā)的炎癥反應(yīng)中一個重要的炎性細(xì)胞因子，通過調(diào)節(jié)IL-8的表達(dá)，在ALI的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。 5．將PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA轉(zhuǎn)染到A549和HPAEC細(xì)胞中，觀察了PBEF過表達(dá)和PBEF表達(dá)下調(diào)對其它的炎性細(xì)胞因子比如IL-16和CC

11、R3基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，PBEF表達(dá)下調(diào)可以降低IL-1β刺激后的A549細(xì)胞中IL-16和CCR3基因mRNA表達(dá)，而PBEF過表達(dá)則可以增加IL-1β刺激后的A549細(xì)胞中IL-16和CCR3基因mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示PBEF可能在炎性通路中是一個重要的信號傳遞者或是始發(fā)者，它作為一個炎性細(xì)胞因子，可以通過調(diào)節(jié)其它的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，在肺部炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。 6．將PBEF基因的cDNA和PBEF的siR

12、NA轉(zhuǎn)染到A549和HPAEC細(xì)胞中，觀察了PBEF過表達(dá)和PBEF表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞通透性的影響。結(jié)果顯示，PBEF過表達(dá)可以使IL-1β刺激后的A549和HPAEC細(xì)胞通透性分別增加44％和65％，而PBEF表達(dá)下調(diào)可以使IL-1β刺激后的A549和HPAEC細(xì)胞通透性分別降低29％和24％。這些結(jié)果表明PBEF可能在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞屏障功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。 以上結(jié)果表明，PBEF作為IL-1β所引發(fā)的炎癥反應(yīng)中一個重