P物質(zhì)及其受體在偏頭痛大鼠中腦的變化及硫酸鎂對其變化的影響.pdf

1、目的: 偏頭痛是神經(jīng)科常見的疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚不完全明確。隨著對神經(jīng)肽的深入研究，發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)肽與偏頭痛發(fā)生有關(guān)，如P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽、神經(jīng)激肽A等。其中，P物質(zhì)作為神經(jīng)遞質(zhì)在感覺信息傳遞和痛覺調(diào)制中的作用越來越多地引起人們的注意。目前的研究認(rèn)為P物質(zhì)對痛覺信息的傳遞可能起雙重作用：一方面作為傷害信息傳入纖維的神經(jīng)遞質(zhì)，在脊髓背角、三叉神經(jīng)脊束核等部位對痛覺傳遞的第一級突觸起促進(jìn)或易化作用；另一方面在腦內(nèi)則發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，對痛覺

2、感受進(jìn)行調(diào)制，降低對痛覺的敏感度。在與偏頭痛相關(guān)的腦區(qū)，如中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫核等處存在豐富的P物質(zhì)及其受體，然而，對在腦內(nèi)的定量表達(dá)很少報(bào)道。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是目前國際公認(rèn)的最準(zhǔn)確、重復(fù)性最好的核酸分子定量定性檢測方法，本研究建立了大鼠P物質(zhì)及其受體的實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法，對偏頭痛大鼠中腦P物質(zhì)及其受體的基因表達(dá)進(jìn)行絕對定量檢測，同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測該部位P物質(zhì)及其受體蛋白水平的表達(dá)變化，探討P物質(zhì)及其受體在偏頭痛病

3、理生理過程中的變化情況。
　　 鎂是人體必需的微量元素，它可以影響眾多細(xì)胞功能，在細(xì)胞內(nèi)起重要作用。臨床應(yīng)用鎂劑預(yù)防、治療偏頭痛發(fā)作，取得了較為滿意的效果。目前研究推測鎂離子可能通過促進(jìn)皮層擴(kuò)散抑制、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、改變腦興奮性、影響血小板功能等多種途徑參與偏頭痛病理生理過程。本研究觀察硫酸鎂干預(yù)下偏頭痛大鼠行為學(xué)、中腦P物質(zhì)及其受體表達(dá)的變化。進(jìn)一步證實(shí)硫酸鎂對偏頭痛的防治作用，同時(shí)探討其機(jī)制。
　　 本研究擬解決如

4、下問題：①觀察偏頭痛大鼠中腦P物質(zhì)及其受體表達(dá)有何變化，進(jìn)而探討P物質(zhì)與偏頭痛發(fā)作的關(guān)系。②動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)硫酸鎂干預(yù)后偏頭痛大鼠行為學(xué)變化，并觀察其變化是否存在劑量依賴性。③明確硫酸鎂對偏頭痛的影響機(jī)制是否與中腦P物質(zhì)及其受體有關(guān)。
　　 方法:
　　 1.動(dòng)物分組、造模與干預(yù)：將成年健康Wistar大鼠72只按隨機(jī)數(shù)字表法分6組：對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫

5、酸鎂對照組、每組12只。對照組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠皮下注射生理鹽水2mL/kg，偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠皮下注射硝酸甘油10mg/kg，建立實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型，以出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)等提示模型動(dòng)物頭部不適的癥狀為造模成功的指標(biāo)。5min后再分別給低劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組大鼠硫酸鎂100mg/kg腹腔注射，高劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂對

6、照組大鼠硫酸鎂300mg/kg腹腔注射。
　　 2.行為學(xué)觀察：觀察偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照組、低劑量硫酸鎂對照組，高劑量硫酸鎂對照組大鼠給予生理鹽水后60min-90min內(nèi)撓頭、爬籠、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)的次數(shù)總和(每個(gè)癥狀出現(xiàn)1次計(jì)1分)。
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組大鼠中腦P物質(zhì)及其受體的表達(dá)：偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照

7、組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠給予生理鹽水后2.0h，10％水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，斷頭取腦。分離出中腦后立即置于液氮中，保存于-70℃冰箱中。取中腦組織50-100mg，根據(jù)總RNA提取試劑盒步驟操作，提取總RNA。經(jīng)凝膠電泳后，使用紫外分光光度儀檢測抽提總RNA的質(zhì)量和濃度。要求A260/A280比值1.9-2.0，并計(jì)算RNA濃度(RNA樣本濃度(μg/μL)=A260×稀釋倍數(shù)×40÷100

8、0)。每一標(biāo)本取總RNA 300ng，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成好的cDNA置-70℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用SP、NK1受體和NK3受體特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收。回收純化的目的基因與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，氨芐青霉素篩選后提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切及測序鑒定后，證實(shí)SP、NK1受體和NK3受體cDNA全長完全正確。將所提取的質(zhì)粒在260nm下測OD260值，計(jì)算拷貝數(shù)，

9、用無菌水10倍系列稀釋、分裝、作為標(biāo)準(zhǔn)品，-20℃保存。將各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體cDNA與相應(yīng)重組質(zhì)粒同時(shí)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體mRNA的絕對表達(dá)量。
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)P物質(zhì)及其受體的分布及表達(dá)：偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組

10、大鼠給予生理鹽水后2.0h，各組大鼠用10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉成功后，打開胸腔，暴露心臟，用小剪刀剪開右心耳，從左心室插管用生理鹽水進(jìn)行灌流，之后緩慢注入10％甲醛100ml固定，斷頭取腦。將完整的鼠腦放入4％多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水透明，低溫石蠟包埋，切片，應(yīng)用SP、NK1受體、NK3受體單克隆抗體行免疫組化染色。光鏡下可見SP、XK1受體、NK3受體免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的胞體和樹突被均勻染成棕色。于400倍光鏡下記錄滑車

11、神經(jīng)核水平中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹側(cè)區(qū)、背側(cè)區(qū)各3個(gè)視野，計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 5.用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，各組大鼠行為學(xué)計(jì)分結(jié)果(撓頭、爬籠、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)的計(jì)分總和)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測出的各組SP mRNA拷貝數(shù)變異較大，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化檢測出的各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹

12、側(cè)區(qū)、背側(cè)區(qū)SP、NK1受體、NK3受體陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.行為學(xué)結(jié)果：低劑量硫酸鎂治療組和高劑量硫酸鎂治療組行為學(xué)改變較偏頭痛組明顯減輕(P<0.05)，而高劑量硫酸鎂治療組大鼠行為學(xué)減輕程度較低劑量硫酸鎂治療組更為明顯(P<0.05)。
　　 2.各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體基因水平表達(dá)情況：

13、偏頭痛組大鼠中腦P物質(zhì)mRNA拷貝數(shù)明顯低于對照組(P<0.05)；低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦P物質(zhì)mRNA拷貝數(shù)明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。高劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦NK1受體mRNA拷貝數(shù)明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦NK3受

14、體mRNA拷貝數(shù)無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)SP、NK1受體和NK3受體蛋白水平表達(dá)情況：高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經(jīng)核水平SP陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經(jīng)核水平SP陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦

15、PAG區(qū)滑車神經(jīng)核水平NK1受體陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經(jīng)核水平NK3受體陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究所建立的檢測大鼠P物質(zhì)及其NK1受體、NK3受體mRNA的SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)和線性范圍廣等

16、特點(diǎn)，適用于對大鼠各種組織P物質(zhì)及其NKi受體、NK3受體mRNA的大量樣本檢測。
　　 2.硝酸甘油10mg/kg皮下注射可以成功建立硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型。該模型行為癥狀表現(xiàn)(耳紅、撓頭、爬籠)與病理生化變化與人類偏頭痛發(fā)作時(shí)的表現(xiàn)及變化有一定的相似性，符合模型設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循的標(biāo)準(zhǔn)化、相似性、重復(fù)性、適用性、經(jīng)濟(jì)性原則，且造模方法簡單、經(jīng)濟(jì)，機(jī)制單一，可在短期內(nèi)大量復(fù)制，是研究偏頭痛較為理想的動(dòng)物模型。在今后的研究中要進(jìn)一步

17、完善該模型行為學(xué)評價(jià)體系，制定統(tǒng)一定量的模型成功標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3。偏頭痛大鼠中腦SP基因水平表達(dá)減少，而SP蛋白水平表達(dá)未見明顯變化，需進(jìn)一步觀察偏頭痛不同時(shí)期SP的表達(dá)，明確SP在偏頭痛發(fā)作過程中的變化規(guī)律。
　　 4.硫酸鎂可以減輕偏頭痛大鼠行為學(xué)癥狀，并具有劑量依賴性。
　　 5.硫酸鎂治療偏頭痛的作用與促進(jìn)中腦SP及NKi受體表達(dá)有關(guān)。
　　 6.硫酸鎂預(yù)防偏頭痛的作用，也可能與其增加中腦SP及N