超聲微泡聯(lián)合Ad-EGFP-HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植治療大鼠心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠心病是影響人類生命健康的主要疾病之一，雖然傳統(tǒng)的藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入治療以及冠脈旁路移植等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使冠心病患者的病死率呈下降趨勢(shì)，但相當(dāng)一部分冠心病患者仍不適宜上述治療方法。心肌血管新生是當(dāng)前缺血性心臟病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用干細(xì)胞移植，通過血管及其心肌細(xì)胞的再生來(lái)治療缺血性心臟?。↖schemic heart disease，IHD），目前研究較多的是單個(gè)核細(xì)胞（Mononuclear cells，MNC

2、s）和間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stemcells，MSCs），但是由于移植成分較復(fù)雜，隨著臨床應(yīng)用例數(shù)的增多，不良反應(yīng)的報(bào)告也日趨增多。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells，ECs）的前體細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管ECs表型，也未形成血管。它包括從血液母細(xì)胞到成熟ECs之間多個(gè)階段的細(xì)胞。EP

3、Cs有促進(jìn)組織器官，尤其是缺血組織器官ECs修復(fù)，建立側(cè)支循環(huán)和恢復(fù)血供的作用，它不僅參與胚胎時(shí)期的血管形成，而且在出生后成體的血管生成中也起重要作用。
　　 干細(xì)胞移植主要有經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射、經(jīng)心內(nèi)膜下注射、開胸心內(nèi)注射及經(jīng)靜脈移植等幾種方式。研究表明，采用上述方式進(jìn)行細(xì)胞移植均可不同程度的改善缺血性心臟病患者的心功能，但是需要高濃度的干細(xì)胞，而且前三種移植方式必須在介入操作情況下才能完成；經(jīng)靜脈干細(xì)胞移植途徑接近于無(wú)創(chuàng)，但大

4、量細(xì)胞可隨血流遷移至其他組織、器官，引起不必要的血管新生。因此，很有必要尋找一種既能通過靜脈途徑輸入又能在靶組織內(nèi)定向轉(zhuǎn)移的細(xì)胞移植方法。
　　 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡作為增強(qiáng)組織灰階顯像的造影劑，也可用于藥物或基因傳遞。將特定的藥物或基因與微泡結(jié)合在一起，通過外周血管注射，經(jīng)體表超聲定位輻照破壞微泡，可使藥物或基因在特定組織內(nèi)定位釋放。微泡破裂后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)可使靶組織微環(huán)境改變，如毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙增寬，細(xì)胞膜通透性增高，

5、從而使藥物或基因進(jìn)入特定的組織內(nèi)。
　　 另外，超聲輻照微泡可以引起局部組織的炎癥反應(yīng)，引起炎細(xì)胞聚集，炎性因子的釋放，從而產(chǎn)生一些潛在的生物學(xué)效應(yīng)。有研究證實(shí)，超聲破壞微泡可增加局部組織血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（Vascularcell adhere molecular-1，VCAM-1）的表達(dá)，從而促進(jìn)骨髓MNCs粘附于內(nèi)皮上，增加MNCs的歸巢數(shù)量。
　　 在諸多用于治療IHD的基因選擇上，缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hy-p

6、oxiainducible factor-1α，HIF-1α）作為機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子日漸引起人們的關(guān)注，HIF廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，可以上調(diào)多達(dá)150種細(xì)胞因子的表達(dá)，是組織、細(xì)胞在缺氧應(yīng)答反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)因子。此外有研究證實(shí)，HIF-1α可以促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（Stromalcell-deftved factor-1，SDF-1）的表達(dá)，而SDF-1作為一種趨化因子，在干細(xì)胞的流動(dòng)及遷移中起非常重要的作用，可增加

7、干細(xì)胞對(duì)缺血組織粘附及歸巢。
　　 基于上述理論基礎(chǔ)，超聲破壞微泡能否作為一種新型的促進(jìn)EPCs定向移植的有效方法有待進(jìn)一步探討，因此本課題利用超聲破壞微泡聯(lián)合載HIF-1α及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green rluorescentprotein，EGFP）的重組腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植，觀察其對(duì)大鼠心肌梗死（Myocardial infarction，MI）的治療效果，為IHD的治療提

8、供一種新的途徑和方法。
　　 綜上，本課題研究主要包括以下三個(gè)部分：
　　 第一部分\大鼠骨髓源性EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:研究大鼠骨髓來(lái)源的EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定方法以及向ECs分化的誘導(dǎo)條件。
　　 方法:Percoll密度梯度離心法分離SD大鼠股骨及脛骨骨髓MNCs，經(jīng)差速貼壁后取2次貼壁細(xì)胞置于纖維連接蛋白鋪被的培養(yǎng)板中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endotheli

9、al growthfactor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growthfactor，bFGF）及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）誘導(dǎo)下培養(yǎng)2w，觀察其形態(tài)學(xué)改變，對(duì)其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（Acetyl low density lipoprotein，acLDL）、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1（Ulex europaeus

10、 agglutinin，UEA-1）雙熒光染色對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)論:采用Percoll密度梯度離心法，在VEGF、bFGF及EGF培養(yǎng)體系下，可以獲得較高純度的EPCs，該細(xì)胞具有ECs的特性，經(jīng)體外誘導(dǎo)可以分化為ECs。
　　 第二部分、 Ad-EGFP/HIF-1α感染大鼠EPCs的實(shí)驗(yàn)
　　 目的:研究含HIF-1α及EGFP的Ad-EGFP/HIF-1α感染大鼠EPCs的可行性。
　　 方法

11、：采用Percoll密度梯度離心法分離SD大鼠骨髓MNCs，VEGF、bFGF及EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)變化，對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)及功能學(xué)鑒定；Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，之后感染體外培養(yǎng)的EPCs，分別于24，48，72，96 h采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表達(dá)EGFP的情況；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；RT-PCR法測(cè)定HIF-1α在EPCs中的表達(dá)。
　　 結(jié)論：重組腺病毒Ad

12、-EGFP/HIF-1α能夠有效地感染EPCs，感染后在mRNA水平可檢測(cè)到HIF-1α的表達(dá)，并對(duì)EPCs活性無(wú)明顯影響，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因的EPCs移植促進(jìn)血管新生奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分、超聲微泡聯(lián)合Ad-EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植治療大鼠心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究
　　 第一節(jié) 超聲微泡聯(lián)合Ad-EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs歸巢大鼠缺血心肌
　　 目的：研究超聲破壞微泡聯(lián)合Ad-EGFP/H

13、IF-1α介導(dǎo)EPCs移植歸巢大鼠缺血心肌的可行性及有效性。
　　 方法：采用Percoll密度梯度離心法分離SD大鼠骨髓MNCs，VEGF、bFGF及EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)改變，對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)及功能學(xué)鑒定；Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，之后感染體外培養(yǎng)的EPCs。將30只SD大鼠建立MI模型后隨機(jī)分為5組：①空白對(duì)照組（C），②超聲+微泡組（US+MB），③內(nèi)皮祖細(xì)胞組（EPCs），④超聲+內(nèi)

14、皮祖細(xì)胞組（Us+EPCs），⑤超聲+微泡+內(nèi)皮祖細(xì)胞組（US+MB+EPCs）。建模成功后第3天，經(jīng)尾靜脈注入超聲微泡，同時(shí)超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照大鼠心前區(qū)，輻照條件：300KHz、2W/c㎡，輻照10s，間隔5s，共5min。建模成功后第5天、第7天行同樣處理，之后通過尾靜脈注射感染Ad-EGFP/HIF-1α的EPCs。EPCs移植后48h將大鼠處死，激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠心肌組織內(nèi)EPCs的分布；Western blot檢測(cè)H

15、IF-1α的表達(dá)。
　　 結(jié)論：超聲破壞微泡聯(lián)合.Ad.EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植可有效促進(jìn)EPCs歸巢，為干細(xì)胞移植治療IHD提供了一種新的途徑。
　　 第二節(jié) 超聲微泡聯(lián)合Ad-EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植治療大鼠心肌梗死的研究
　　 目的：研究超聲破壞微泡聯(lián)合Ad-EGFP/HIF-1α介導(dǎo)EPCs移植治療大鼠MI的可行性。
　　 方法：采用Percoll密度梯度離心法分離SD

16、大鼠骨髓MNCs，VEGF、bFGF及EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)改變，對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)及功能學(xué)鑒定；Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，之后感染體外培養(yǎng)的EPCs。將30只SD大鼠建立MI模型后隨機(jī)分為5組：①空白對(duì)照組（C），②超聲+微泡組（US+MB），③內(nèi)皮祖細(xì)胞組（EPCs），④超聲+內(nèi)皮祖細(xì)胞組（uS+EPCs），⑤超聲+微泡+內(nèi)皮祖細(xì)胞組（US+MB+EPCs）。建模成功后第3天，經(jīng)尾靜脈注入超聲微泡，

17、同時(shí)超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照大鼠心前區(qū)，輻照條件：300KHz、2W/c㎡，輻照10s，間隔5s，共5min。建模成功后第5天、第7天行同樣處理，之后通過尾靜脈注射感染Ad-EGFP/HIF-1α的EPCs。EPCs移植后4w，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠左室收縮功能，HE染色檢測(cè)心肌梗死邊緣區(qū)新生血管情況，免疫組織化學(xué)（Immunohis-tochemistry，IHC）染色法檢測(cè)CD34的表達(dá)及微血管密度（Microvesseldensity，