基于合理設計的聚合物納米給藥系統(tǒng)用于提高蛋白質(zhì)多肽藥物和siRNA體內(nèi)外功效.pdf

1、基于納米載體的藥物遞送系統(tǒng)可提高藥物穩(wěn)定性、控釋藥物、促進藥物體內(nèi)吸收、改善治療功效和降低毒副作用。為了充分發(fā)揮納米載體的上述作用特點，必須全面系統(tǒng)研究其體內(nèi)外作用機制，為合理設計納米給藥載體提供理論和實驗依據(jù)。蛋白質(zhì)多肽藥物和基因等生物大分子因水溶性好、分子量大、體內(nèi)生理環(huán)境影響其活性和穩(wěn)定性等，透膜吸收較差，需借助載體遞送方可更好發(fā)揮其功效。尤其是口服給藥不借助載體遞送根本無法有效使用，其中納米載體是其主要的遞送系統(tǒng)。納米載體的理化

2、性質(zhì)如粒徑、表面電荷等影響其細胞攝取、口服吸收和體內(nèi)生物分布，研究其影響規(guī)律和機制，據(jù)此合理設計高效納米遞送系統(tǒng)。
　　本文以殼聚糖衍生物聚合物納米粒為模型，研究其粒徑、表面電荷等理化性質(zhì)對蛋白質(zhì)多肽藥物體內(nèi)外吸收、分布的影響規(guī)律及機制。設計同時具有主動靶向作用、促進藥物口服吸收和細胞攝取，并可有效克服小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)藥物體內(nèi)外遞送屏障、介導高效體外基因沉默和口服后體內(nèi)RNA

3、干擾（RNA interference，RNAi）功效的新型多功能殼聚糖衍生物-甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽(MTC)納米粒，研究其作為腫瘤壞死因子-α(TNF-α) siRNA口服給藥遞送載體的載藥與釋藥、體內(nèi)外作用機制、口服給藥對脂多糖(LPS)/D-半乳糖胺(D-GalN)誘導小鼠或大鼠急性肝損傷及葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠潰瘍性結腸炎的治療功效。
　　1聚合物納米粒粒徑與表面電荷對細胞攝取和生物分布的影響
　　研

4、究載蛋白質(zhì)多肽藥物聚合物納米粒粒徑、表面電荷對納米粒細胞攝取及動物體內(nèi)生物分布的影響和機制?？煽刂苽淞綖?50、500、1500 nm和Zeta電勢為-15、-25、-40 mV的羅丹明B熒光標記羧甲基殼聚糖納米粒RhB-CMCNP，包載FITC熒光標記的蛋白質(zhì)多肽模型藥物硫酸魚精蛋白(HTC-PS)，制得雙熒光標記的載藥聚合物納米粒RhB-CMCNP-PS，研究表明血漿及(I)-環(huán)境中熒光穩(wěn)定。研究了RhB-CMCNP-PS的細胞攝

5、取，結果表明:荷較強負電且粒徑較大的RhB-CMCNP-PS更易被小鼠腹腔巨噬細胞吞噬;荷較弱負電且粒徑較小的RhB-CMCNP-PS更易被非巨噬細胞攝取，且納米粒攝取行為呈細胞株依賴性;納米粒在非巨噬細胞主要通過代謝能量依賴的、肌動蛋白介導的內(nèi)吞入胞。H-22荷瘤昆明小鼠尾靜脈注射RhB-CMCNP-PS后，荷較弱負電且粒徑較小的納米粒及所載藥物更易在腫瘤部位蓄積。
　　2聚合物納米粒粒徑對蛋白質(zhì)藥物口服吸收的影響
　　研

6、究載蛋白質(zhì)多肽藥物聚合物納米粒粒徑對藥物釋放、細胞攝取、小腸轉運、口服吸收和動物體內(nèi)生物分布的影響及機制?？煽刂苽鋃eta電勢為-35 mV、粒徑分別為300、600、1000nm的羅丹明B熒光標記羧化殼聚糖納米粒RhB-CCNP，包載FITC熒光標記的蛋白質(zhì)多肽模型藥物牛血清白蛋白(FITC-BSA),制得雙熒光標記的載藥聚合物納米粒RhB-CCNP-BSA，研究表明血漿及含有各種類型化學熒光淬滅劑的溶液中熒光穩(wěn)定。研究了粒徑對RhB

7、-CCNP-BSA的親水性、Caco-2細胞攝取量、大鼠小腸黏膜黏附性、體外Caco-2細胞單層模型轉運和吸收量、大鼠離體小腸轉運和在體小腸吸收量的影響，結果表明均隨粒徑減小而增加。研究了RhB-CCNP-BSA的大鼠小腸在體釋放，結果表明:粒徑較小的RhB-CCNP可釋放更多FITC-BSA至大鼠小腸黏膜而非腸腔中，避免FITC-BSA被腸腔內(nèi)消化酶降解失活。小腸派氏結處M細胞是載藥聚合物納米粒轉運和吸收的重要部位。健康昆明小鼠口服給

8、藥后，RhB-CCNP-BSA在血液和主要臟器的分布比例隨粒徑減小而增大;H-22荷瘤昆明小鼠口服給藥后，粒徑較小的RhB-CCNP-BSA經(jīng)小腸轉運吸收，可有效遞送至血液和主要組織中。
　　3基于MTC的siRNA口服高效納米給藥系統(tǒng)用于急性肝損傷的治療及機制
　　殼聚糖(Mw200 kDa、500 kDa)經(jīng)季銨化、甘露糖和巰基基團修飾制得MTC聚合物-MTC200和MTC500，季銨化度均為30％，甘露糖修飾度分別為1

9、1％和15％，游離巰基含量分別為109.7±2.5和105.4±3.1μmol/g，二硫鍵含量分別為180.5±0.8和197.3±0.6μmol/g;與TPP離子交聯(lián)制備納米粒，包載TNF-αsiRNA，粒徑約150nm，Zeta電勢約30 mV;納米粒在生理環(huán)境結構穩(wěn)定，保護siRNA免受核酶降解。MTC納米粒可改善siRNA口服后的小腸轉運和吸收，經(jīng)全身血液循環(huán)、淋巴循環(huán)和巨噬細胞等作用遞送siRNA至全身主要組織。研究了MTC納

10、米粒的巨噬細胞攝取，結果表明:MTC納米粒促進巨噬細胞對siRNA的攝取及胞質(zhì)釋放，細胞攝取機制主要涉及小窩蛋白介導的內(nèi)吞和巨胞飲，與網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞無關，可避免被溶酶體捕獲。研究了載siRNA MTC納米粒的巨噬細胞基因沉默效果，結果表明:MTC納米粒體外可高效介導Raw264.7細胞和小鼠原代腹腔巨噬細胞的RNAi效應。LPS/D-GalN誘導急性肝損傷C57BL/6小鼠口服載siRNA MTC納米粒后，血清TNF-α、谷丙轉氨酶

11、(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量和組織巨噬細胞TNF-α mRNA表達均顯著降低，肝臟切片觀察表明小鼠肝臟損傷得到顯著緩解，小鼠存活率顯著提高。與腹腔注射給藥相比，C57BL/6小鼠口服MTC納米粒后可將siRNA高效遞送至血液和全身主要組織，體內(nèi)基因沉默效率亦顯著提高。LPS/D-GalN誘導急性肝損傷SD大鼠口服載siRNA MTC納米粒后，血清TNF-α和組織巨噬細胞TNF-α mRNA表達均顯著降低，肝臟切片觀察表明大鼠肝臟

12、損傷得到顯著緩解。C57BL/6小鼠口服MTC200NPs毒性試驗結果表明MTC200 NPs安全性良好。
　　4基于MTC的siRNA口服高效納米給藥系統(tǒng)用于潰瘍性結腸炎的治療及機制
　　調(diào)節(jié)MTC200與TPP的質(zhì)量比，離子交聯(lián)法制備粒徑分別為150、1000nm和Zeta電勢為30 mV的MTC200 NPs和MTC200 LNPs，包載TNF-α siRNA。研究了MTC200 NPs和MTC200 LNPs的結構穩(wěn)

13、定性、siRNA體外釋放、巨噬細胞攝取和基因沉默、Caco-2細胞單層轉運，結果表明:二種納米粒生理環(huán)境結構穩(wěn)定，體外siRNA釋放、Raw264.7細胞攝取和Raw264.7細胞體外基因沉默效率均無顯著差異;但MTC200 LNPs的Caco-2細胞單層轉運和攝取量顯著低于MTC200 NPs。健康C57BL/6小鼠口服載siRNA MTC200 LNPs后血液和主要組織中siRNA的含量顯著低于MTC200 NPs;潰瘍性結腸炎C5

14、7BL/6小鼠口服載siRNA MTC200 LNPs后可避免被小腸正常上皮組織吸收而特異性聚集在炎癥部位并促進巨噬細胞的攝取，故與MTC200 NPs相比，MTC200 LNPs在結腸局部炎癥部位的siRNA分布百分比顯著提高。研究了潰瘍性結腸炎小鼠口服載siRNAMTC200 LNPs和MTC200 NPs的體內(nèi)RNAi功效，結果表明:小鼠結腸組織TNF-α含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的相對表達和MPO

15、含量均顯著降低，顯著緩解小鼠體重下降和結腸組織局部炎癥，MTC200 LNPs的治療效果優(yōu)于MTC200 NPs。C57BL/6小鼠口服MTC200 NPs毒性試驗表明MTC200LNPs安全性良好。
　　5 MTC納米粒的siRNA結合-釋放與體內(nèi)外轉染效率的關系
　　選用三聚磷酸鈉(TPP)、透明質(zhì)酸(HA，Mw100 kDa)和丙烯酸樹脂Ⅲ號(Eudragit S100，ES)為離子交聯(lián)劑，與MTC聚合物經(jīng)離子交聯(lián)法制

16、備7種納米粒，包載TNF-α siRNA，通過改變離子交聯(lián)劑種類和比例調(diào)節(jié)siRNA的釋放速度;制得MTC納米粒粒徑為120-225 nm、Zeta電勢為18-37 mV，多分散系數(shù)(P.I.)均小于0.3，粒徑分布均勻;MTC納米粒的包封率均高于98％。MTC納米粒結構穩(wěn)定，可有效保護siRNA在小鼠體液中免遭核酶降解。最低肝素鈉解離濃度試驗和體外釋放試驗結果表明，MTC納米粒對siRNA的結合能力隨離子交聯(lián)劑種類的增多、離子交聯(lián)劑中

17、HA和ES比例的升高而增大，siRNA的釋放速率和累積釋放量與之相反。MTC納米粒細胞黏附、細胞攝取量和細胞攝取速度均無顯著性差異。研究了MTC納米粒介導體外Raw264.7基因沉默效果，結果表明:緩慢釋放siRNA的MTC納米粒高效介導長時程基因沉默，可用于口服給藥有效治療C57BL/6小鼠慢性局部炎癥-潰瘍性結腸炎;快速釋放siRNA的MTC納米粒高效介導短時程基因沉默，可用于口服給藥有效治療C57BL/6小鼠急性全身性炎癥-急性肝