siRNA干擾Rac1基因表達及其抑制大鼠視網膜新生血管生成機制的研究.pdf

1、目的： 在眼部疾病中，血管增生過度是一大類致盲性眼病的根本原因，其中視網膜新生血管性疾病占據較大比例。視網膜新生血管的生長及其所致的出血、滲出、增生等是多種致盲眼病的主要病理過程。血管新生是多種分子共同作用的結果，而已往的研究多是針對單分子來控制血管新生，、這些方法雖然顯示出一定抑制作用，但畢竟單分子作用是微弱的，故抗血管新生的作用也是有限的。近年來的研究表明Racl可能是調控多種血管生成相關因素的關鍵分子。為探討Racl對于視

2、網膜新生血管的調控作用，本研究采用RNA，干擾技術抑制Racl基因表達，觀測其對視網膜新生血管生成及其相關生長因子表達的抑制作用。 方法： 1．第一部分Racl—siRNA表達載體構建 1.1以人Racl mRNA為模板，設計與大鼠同源的、針對Racl基因編碼區(qū)的Racl—siRNA序列，并在體外轉錄合成。 1.2雙酶切pSUPER質粒，與Racl—siRNA鏈連接，構建Racl—siRNA表達載體，轉化

3、感受態(tài)細胞(E.coli)后采用菌落PCR、雙酶切(Bgl lI和HindⅢ)進行分離純化，Sanger序列分析法進行載體鑒定。 1.3將構建的載體對HeLa細胞進行轉染，觀察各載體的轉染效果。收集HeLa細胞進行RT—PCR，篩選出抑制效果較好的載體，抽提后進行動物實驗。 2. 第二部分大鼠視網膜新生血管模型的建立 2.1視網膜新生血管模型建立：健康成年SD大鼠50只，常規(guī)麻醉后，尾靜脈注射虎紅，532nm激

4、光光凝視網膜主要靜脈，建立視網膜新生血管動物模型。 2.2光凝術后2周，采用心內注射FITC—dextran，視網膜鋪片法觀察新生血管生成的情況。 3. 第三部分Racl—siRNA抑制大鼠視網膜新生血管生成的體內實驗 3.1大鼠玻璃體腔載體轉染情況檢測：玻璃體腔轉染重組載體和空白載體后4天，行眼球冰凍切片。熒光顯微鏡下觀察兩種載體對活體視網膜組織的轉染情況。 3.2采用50只成年SD大鼠，光動力法誘導

5、視網膜靜脈阻塞后，玻璃體腔轉染Racl—siRNA載體作為基因干預組；另眼注射空白載體作為空白對照組；同時采用正常同齡大鼠25只單眼玻璃體腔內注射Racl—siRNA載體作為空白干預組。 3.3 2周后對3組動物進行心內灌注FITC—dextran，視網膜鋪片，檢測 視網膜新生血管生成情況。3.4取出3組大鼠眼球，常規(guī)石蠟包埋，矢狀面連續(xù)切片，HE染色后顯微鏡下觀測視網膜各層細胞的形態(tài)改變，計數突破內界膜的內皮細胞數，進

6、行統(tǒng)計學分析。 3.5免疫組織化學法從蛋白水平檢測各組大鼠視網膜內血管生成相關因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的表達情況。檢測平均光密度值，進行統(tǒng)計學分析。 3.6提取各組大鼠視網膜總RNA，應用RT-PCR方法檢測視網膜中血管生成因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的含量，進行數據歸納和統(tǒng)計學分析。 結果： 1. 第一部分，Racl-siRNA表達載體構建 1.

7、1成功構建3種Racl-siRNA重組載體并進行了分離純化，獲得高度純化的重組載體。載體序列鑒定驗證所得載體序列與設計序列完全吻合。 1.2采用HeLa細胞對重組載體的轉染效果進行初步檢測。結果顯示構建的3種重組載體對HeLa細胞的轉染率都高達70％以上。 1.3收集HeLa細胞，提取RNA，進行RT-PCR，檢測3種重組載體對Racl mRNA的抑制率。結果顯示與空白載體相比，3種重組載體均有明顯的抑制效果，其中載體1

8、和載體2抑制效果較好。 1.4綜合各方面條件，篩選轉染率和抑制率較高的載體2，大量抽提后為下一步動物實驗作準備。 2．第二部分大鼠視網膜新生血管模型的建立 2.1光凝手術時，可見視網膜靜脈內明顯黑色血栓形成，靜脈粗細不均，遠端靜脈迂曲、擴張。 2．2光凝后第2天行眼底檢查發(fā)現：視網膜主要靜脈迂曲粗大、可見栓塞引起出血。 2.3 2周后FITC-dextran心內灌注視網膜鋪片顯示光凝眼與對照眼視

9、 網膜血管形態(tài)：對照眼大鼠視網膜見深淺兩層血管網，從視神經周圍發(fā)出走向視網膜周邊。淺層血管呈放射狀分布，深層血管呈網狀分布。光凝眼視網膜血管形態(tài)和分布發(fā)生明顯改變，失去正常的放射狀和網狀結構，出現大量新生血管芽和新生血管枝，視網膜血管雜亂、縱橫交錯、熒光素滲漏。 3.第三部分Racl-siRNA抑制大鼠視網膜新生血管生成的體內實驗 3.1轉染4天后，各選取2只大鼠行眼球冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察，可見視網膜區(qū)域呈

10、現綠色熒光。從而證明重組載體和空白載體對活體視網膜組織的轉染率都較高。 3．2光凝2周后FITC-dextran心內灌注視網膜鋪片發(fā)現：空白對照組視網膜血管雜亂，縱橫交錯，產生大片狀新生血管，大量熒光素滲漏。 基因干預組僅見小片狀新生血管網，少量熒光素滲漏?？瞻赘深A組呈正常血管形態(tài)。 3.3基因干預組大鼠視網膜切片中，突破內界膜的血管內皮細胞平均數與空白對照組和空白干預組比較，兩兩間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

11、 3．4視網膜免疫組織化學染色顯示：基因干預組、空白對照組與空白干預組相比，視網膜中Racl、VEGF、HIF-1 α和NF－kB的表達較強，空白對照組最強。平均光密度值差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.5 RT-PCR檢測Racl、VEGF、HIF-1α和NF-<,к>B在基因干預組和空白對照組中與空白干預組相比表達較強。但基因干預組與空白對照組相比，上述4個因子表達下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

12、 結論： 本研究表明：體外重組的Racl—siRNA表達載體能有效的抑制體內視網膜新生血管的生成，并且從蛋白水平、基因水平證明能下調多種視網膜內與血管生成相關生長因子的表達水平。其作用機制為：干擾RNA技術抑制Racl基因表達，從而抑制HIF—1α表達，阻斷了血管新生相關生長因子的上游信號途徑，下調了它們的表達，從而抑制新生血管生成。同期觀察未見重組載體對視網膜有明顯的毒副作用。本研究為視網膜新生血管性疾病的基因治療方案，