Akt對哮喘小鼠肺組織內(nèi)VEGF、IL-1β以及內(nèi)臟感覺傳入部位IL-1β表達(dá)的影響.pdf

1、支氣管哮喘是一種免疫源性炎癥氣道疾病，以氣道平滑肌痙攣及漸進(jìn)性氣道高反應(yīng)為主要特點，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來，神經(jīng)源性炎癥越來越受到關(guān)注，但對于神經(jīng)系統(tǒng)與這些炎癥過程復(fù)雜的相互作用了解甚少。最近研究表明神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是一個重要介質(zhì)。哮喘患者血清NGF水平增高，支氣管哮喘動物模型的研究結(jié)果顯示NGF能引起氣道高反應(yīng)，外源性NGF可引起豚鼠對組胺的氣道高反應(yīng)增加，應(yīng)用NGF抗體可大大減少

2、哮喘引起的氣道高反應(yīng)。近年來，本室的研究結(jié)果證實：NGF在哮喘豚鼠下呼吸道、肺內(nèi)炎性細(xì)胞和感覺神經(jīng)節(jié)等內(nèi)臟感覺傳入部位過表達(dá)。 PBK/Akt既是PI3K的一個重要的下游調(diào)節(jié)激酶，在糖代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞抗凋亡過程中均起著重要的作用，但它又可不依賴于PI3K途徑而被NGF激活，NGF激活TrkA使其與SH2-B β結(jié)合，促使SH2-B β發(fā)生洛氨酸磷酸化，SH2-Bβ再作用于Akt/PKB，Akt/PKB進(jìn)一步激活分插頭轉(zhuǎn)錄因

3、子，促使PC12細(xì)胞分化增殖。最近本室有研究提示，Akt/PKB很可能參與了哮喘發(fā)病機(jī)制中NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路但它如何參與哮喘調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不十分清楚。 有研究顯示，哮喘發(fā)作期和緩解期患者血清IL-1β水平明顯高于對照組；鼠哮喘模型肺組織及C7-T5節(jié)段脊神經(jīng)和相應(yīng)節(jié)段脊髓后角IL-1 β mRNA和肺泡灌洗液中IL-1β水平均明顯升高。前炎癥因子IL-1β可上調(diào)氣道上皮細(xì)胞TGF-β 1mRNA表達(dá)，從而對氣道上皮的損傷進(jìn)行

4、修復(fù)，當(dāng)過度調(diào)節(jié)后可導(dǎo)致氣道重塑。白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)能明顯減少肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量，促進(jìn)嗜酸性細(xì)胞凋亡。這都提示著IL-1β在哮喘發(fā)病中有著重要作用，但是IL-1 β是否參與了Akt/PKB調(diào)節(jié)的哮喘發(fā)病機(jī)制，是一個值得探討的問題。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)屬于血小板源生長因子家族，是由兩個相同多肽鏈通過二硫鍵形成的同源二聚體糖蛋白。多種細(xì)胞可分泌V

5、EGF，特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，增加血管通透性和血管緊張性，還可促進(jìn)胚胎期血管形成。有研究顯示，哮喘模型大鼠肺組織中VEGF及其受體Flk-1表達(dá)上調(diào)，并與氣道平滑肌增殖有密切關(guān)系，該結(jié)果提示VEGF及其受體可能參與了哮喘氣道重建中氣道平滑肌增殖的過程。王修珍等也證明了白三烯受體拮抗劑可以降低哮喘豚鼠肺組織VEGF表達(dá)水平，從而減少血管增生，延緩哮喘氣道重塑的發(fā)生。還有實驗提示地塞米松可能通過降低VEGF,糾正血管生

6、成促進(jìn)因子/抑制因子比例失衡部分地抑制氣道血管生成，延緩氣道重塑，這都提示著VEGF在哮喘發(fā)病中有著重要作用，Akt/PKB作為維持細(xì)胞存活的一個重要蛋白，極有可能參與了新血管的形成過程，但目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道，本研究旨在探討在哮喘中Akt/PKB與VEGF的關(guān)系。 本文利用免疫組織化學(xué)和Western blot方法，觀察在PKB/Akt被阻斷后，哮喘小鼠肺組織內(nèi)VEGF、IL-1 β以及內(nèi)臟感覺傳入部位IL-1 β表達(dá)的影響

7、，探討PKB/Akt蛋白是否通過調(diào)節(jié)炎性因子IL-1 β以及血管內(nèi)皮生長因子VDGF參與哮喘發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)。通過這些問題的解決，我們將進(jìn)一步清楚哮喘發(fā)病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。 材料和方法 一、實驗材料 1、實驗動物 本研究采用雌性BALB/c小鼠30只，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，均為雌性，體重在18～25g。 2、主要試劑 兔抗小鼠IL-1β抗體，兔抗小鼠V

8、EGF抗體均購于武漢博士德試劑公司；辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫組化試劑盒均購于武漢博士德試劑公司；β-actin，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體均購于北京中山公司； 3、主要儀器 AniRes動物肺功能分析系統(tǒng)；RES1030信號調(diào)理器；電熱恒溫干燥箱；電子分析天平；恒溫水浴箱：低溫冷凍離心機(jī)；紫外分光光度計；通用電泳儀；轉(zhuǎn)印儀；正置熒光顯微鏡；-80度深低溫

9、冰箱：恒溫冰凍切片機(jī)；Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng)； 二、實驗方法 1、制備哮喘模型 腹腔注射卵蛋白致敏BABL/C小鼠，霧化吸入卵蛋白激發(fā)致喘。 2、免疫組織化學(xué)檢測 各組小鼠肺組織VEGF和IL-1β的表達(dá)，檢測C7-T5節(jié)段脊神經(jīng)和相應(yīng)節(jié)段脊髓后角IL-1β的表達(dá)。 3、Western blot方法 檢測各組小鼠肺組織VEGF和IL-1β的表達(dá)

10、，檢測C7-T5節(jié)段脊神經(jīng)IL-1β的表達(dá)。 4、圖象分析 Western blot結(jié)果用Chemi Imager5500V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。免疫組化結(jié)果用Motic Images Advanced 3.2實時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行定量分析。 5、統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較進(jìn)

11、行t檢驗。 實驗結(jié)果： 一、IL-1β 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：哮喘組肺、C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓后角IL-1β陽性產(chǎn)物的平均光密度值(MOD)顯著高于生理鹽水組(P<0.01)；而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比，肺組織及C7-T5節(jié)段脊神經(jīng)和相應(yīng)節(jié)段脊髓后角內(nèi)IL-1β陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結(jié)果顯示：與生理鹽水組比較，哮喘組小鼠肺、C7～

12、T5段脊神經(jīng)中IL-1β目標(biāo)帶的IDV(integrated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.01)，而PKB/Akt阻斷組上述部位樣品中IL-1β目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于哮喘組(P<0.05)． 二、VEGF 免疫熒光結(jié)果顯示：哮喘組肺組織內(nèi)VEGF陽性產(chǎn)物的平均光密度值(MOD)顯著高于正常對照組(P<0.01)；而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比，上述部位VE

13、GF陽性反應(yīng)產(chǎn)物的MOD值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結(jié)果顯示：與正常對照組比較，哮喘組小鼠肺組織內(nèi)VEGF的IDV(inte grated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.01)，而PKB/Akt阻斷組上述部位樣品中IL-1β目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于哮喘組(P<0.05)． 討論 IL-1曾稱為淋巴細(xì)胞活化因子，在哮喘發(fā)病中起著重要

14、作用。有研究顯示，哮喘發(fā)作期和緩解期患者血清IL-1β水平明顯高于對照組；前炎癥因子IL-1β可上調(diào)氣道上皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)，從而對氣道上皮的損傷進(jìn)行修復(fù)，當(dāng)過度調(diào)節(jié)后可導(dǎo)致氣道重塑。白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)能明顯減少肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量，促進(jìn)嗜酸性細(xì)胞凋亡。這都提示著IL-1β在哮喘發(fā)病中有著重要作用．在本實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘組肺、C7-T5段脊神經(jīng)

15、節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓后角IL-1β陽性產(chǎn)物顯著高于正常對照組；而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比，上述部位IL-1β陽性反應(yīng)產(chǎn)物明顯降低，提示Akt很可能通過調(diào)節(jié)IL-1β的表達(dá)來參與哮喘發(fā)病機(jī)制的調(diào)解。 多種細(xì)胞可分泌VEGF，特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，增加血管通透性和血管緊張性，還可促進(jìn)胚胎期血管形成。有研究顯示，哮喘模型大鼠肺組織中VEGF及其受體Flk-1表達(dá)上調(diào)，并與氣道平滑肌增殖有密切關(guān)系，該結(jié)果提示V

16、EGF及其受體2可能參與了哮喘氣道重建中氣道平滑肌增殖的過程。王修珍等[2]也證明了白三烯受體拮抗劑可以降低哮喘豚鼠肺組織VEGF表達(dá)水平，從而減少血管增生，延緩哮喘氣道重塑的發(fā)生。這都提示著VEGF在哮喘發(fā)病中有著重要作用。本實驗研究證明，哮喘組肺組織內(nèi)VEGF陽性產(chǎn)物顯著高于正常對照組；而PKB／Akt阻斷組與哮喘組相比，上述部位VEGF陽性反應(yīng)產(chǎn)物明顯降低，提示Akt很可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來參與哮喘發(fā)病機(jī)制的調(diào)解。本研究進(jìn)一