靶向性抗腫瘤融合蛋白EGF-E4orf4的酵母嗜性表達(dá)和生物功能的進(jìn)一步研究.pdf

1、腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病.近年來盡管抗腫瘤藥物已有了很大的發(fā)展,但仍存在著針對(duì)性差,殺傷正常細(xì)胞的毒副作用.因此研制出一種能夠靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的基因工程藥物有重大的理論和實(shí)踐意義.本組前期工作中利用EGF與EGFR結(jié)合的靶向性及腺病毒E4orf4蛋白的細(xì)胞毒性,通過基因重組及酵母表達(dá)技術(shù),已設(shè)計(jì)并表達(dá)了一種新的融合蛋白EGF-E4orf4,前期的工作表明該融合蛋白對(duì)MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞株有抑制作用,但尚存在EGF-E4

2、orf4的酵母表達(dá)量低,純化回收率低等問題.本論文在此基礎(chǔ)上,對(duì)如何提高EGF-E4orf4的表達(dá)量及對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行更深一步的探討.本論文的第一部分工作是利用DNA重組技術(shù),構(gòu)建表達(dá)載體,并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋自MBP-E4orf4,經(jīng)直鏈淀粉親和柱層析得到較純的融合蛋白,用此免疫新西蘭白兔,獲得了抗MBP-E4orf4的多克隆抗體,為以后鑒定酵母表達(dá)的EGF-E4orf4及細(xì)胞免疫熒光做準(zhǔn)備.本論文的第二部分工作是提高融合

3、蛋白EGF-E4orf4在酵母中的表達(dá)量.通過選用酵母嗜性密碼子,人工合成E4orf4的編碼基因,構(gòu)建由酵母嗜性密碼子組成的EGF-E4orf4多拷貝酵母表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染蛋白酶A缺陷型Pp酵母菌株SMD1168,優(yōu)化表達(dá)條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:酵母嗜性融合蛋白EGF-E4orf4的表達(dá)量達(dá)13mg/L,產(chǎn)量較以前提高了50%.最后一部分工作是進(jìn)一步研究融合蛋白EGF-E4orf4的生物學(xué)功能.綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以看出融合蛋白EGF-E4or