PTSD大鼠海馬和下丘腦5-HT1A受體活性及前額皮質(zhì)ERK變化的實驗研究.pdf

1、前言
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是指在強烈的精神創(chuàng)傷后發(fā)生的心理、生理的應(yīng)激反應(yīng)所表現(xiàn)出的一系列臨床綜合癥,是應(yīng)激精神疾病中最為典型的一種。其核心癥狀可以簡述為闖入性再體驗、警覺性增高及反應(yīng)麻木。隨著戰(zhàn)爭、社會暴力、重大交通事故和自然災(zāi)害等意外事件的逐漸增多,PTSD發(fā)生率也愈加增高?，F(xiàn)今,PTSD以其發(fā)病率高、病程長、難以治愈等特點,嚴重影響人們身心健康而備受關(guān)

2、注。國內(nèi)外對PTSD進行了大量研究,但其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究表明,HPA軸負反饋增強是PTSD的神經(jīng)內(nèi)分泌一個特征。神經(jīng)遞質(zhì)5一羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)及其受體在HPA軸負反饋調(diào)節(jié)中起重要作用。5-羥色胺1A受體在情緒和精神調(diào)節(jié)中起重要作用。但其在PTSD中的作用目前研究不一。ERK1/2在包括神經(jīng)元在內(nèi)的許多細胞中均起重要作用,但目前對SPS時腦內(nèi)神經(jīng)元中ERK分子磷酸化的研究還只是剛剛起

3、步。
　　 單一連續(xù)刺激(single prolonged stress,SPS)是PTSD動物模型的理想方法,該方法已經(jīng)被國際所認同。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型,測定大鼠行為學改變和血清皮質(zhì)醇濃度,驗證PTSD模型的準確性。為探討5-HT1A受體對GR和CRF的影響,我們利用5-HT1A特異性阻斷劑作用于SPS大鼠,觀察大鼠海馬GR和下丘腦CRF的變化。并觀察SPS大鼠mPFC中磷酸化的ERK1/2和c-fos的

4、變化,探討ERK通路抑制劑PD98059的作用。為揭示PTSD的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法
　　 1、PTSD大鼠行為學改變
　　 將Wistar大鼠隨機分為對照組和模型組。采用SPS方法建立PTSD模型。采用曠場(open-field,OF)實驗、高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗、Morris水迷宮(Morris water mace,MWM)實驗進行行為學測定,并測

5、定大鼠的恐懼記憶的行為(僵立行為測定),采用化學發(fā)光法檢測大鼠血清皮質(zhì)醇濃度。
　　 2、PTSD大鼠5-HT1A受體活性與海馬GR和下丘腦CRF表達的關(guān)系
　　 大鼠分為四組:(1)正常對照組(normal group),大鼠既不給予SPS處理,也不給予藥物干預；(2)假手術(shù)組(sham group),實驗動物不給予SPS處理,但給予等體積的溶劑；(3)模型組(SPS group),實驗動物給予SPS處理,處理前給予等

6、體積溶劑；(4)阻斷組(blockade group),實驗動物給予SPS處理和5-HT1A受體拮抗劑WAY100635。膠體金免疫電鏡觀察5-HT1A在海馬和下丘腦神經(jīng)元內(nèi)的分布。免疫組織化學方法分析海馬GR和下丘腦CRF表達。Westernblotting分析海馬GR表達。RT-PCR分析GR mRNA和CRF mRNA變化。
　　 3、PTSD大鼠前額皮質(zhì)磷酸化細胞外信號轉(zhuǎn)導激酶的變化
　　 大鼠被隨機分為三組:對

7、照組、SPS組和PD98059+SPS組。SPS組和PD98059+SPS組大鼠給予SPS,并在SPS前30min分別雙側(cè)注入生理鹽水和PD98059,對照組大鼠給予等體積生理鹽水。用SABC法進行mPFC部位的pERK1/2的免疫組織化學染色,將染色后的切片經(jīng)自動圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。Western blotting分析mPFC部位的pERK1/2。RT-PCR分析c-fos mRNA表達
　　 結(jié)果
　　 一、

8、PTSD大鼠行為學改變
　　 1、OF實驗結(jié)果
　　 兩組大鼠在曠場箱內(nèi)主要在箱壁區(qū)域活動,其運動符合嚙齒類動物的趨觸性(thigmotaxis)的自然屬性,即嚙齒類動物趨向于沿壁活動。模型組大鼠中央格停留時間和直立次數(shù)顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余指標兩組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 2、EMP實驗結(jié)果
　　 EMP結(jié)果表明,大鼠活動符合大鼠趨暗的自然屬性,即大

9、鼠趨向于在光線暗處活動,大鼠在閉臂內(nèi)活動時間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對環(huán)境的逐漸適應(yīng),大鼠向開臂內(nèi)的探究行為逐漸增多。模型組大鼠在開臂內(nèi)停留時間所占總臂內(nèi)停留時間比顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組大鼠進入開臂次數(shù)占總進臂次數(shù)的百分比顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3、MWM實驗結(jié)果
　　 模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。<

10、br>　　 4、僵立行為測定結(jié)果
　　 模型組大鼠再次放入強迫游泳玻璃缸中(重新面臨恐懼情景時)后,大鼠表現(xiàn)為明顯的僵立行為。對照組大鼠重新面臨恐懼情景時,行為模式與模型組顯然不同,表現(xiàn)為自由運動,出現(xiàn)探究、理毛等行為。對照組僵立行為百分比顯著低于模型組,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 5、血清皮質(zhì)酮濃度
　　 模型組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

11、　　 二、PTSD大鼠5-HT1A受體活性與海馬GR受體和下丘腦CRF表達的關(guān)系
　　 1、GR和CRF免疫組化分析結(jié)果
　　 GR的陽性細胞主要分布于海馬的CA1區(qū)。正常對照組和假手術(shù)組之間GR表達沒有明顯差異。與正常對照組和假手術(shù)組相比較,模型組GR表達增高,陽性細胞明顯增多(P<0.01),而阻斷組陽性細胞數(shù)量則比SPS組減少(P<0.05),但仍高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01)。正常對照組和假手術(shù)組之間

12、下丘腦CRF表達沒有明顯差異,模型組CRF表達明顯高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01),而阻斷組陽性細胞數(shù)量則比SPS組減少(P<0.05)。
　　 2、Western blotting分析海馬GR表達
　　 正常對照組和假手術(shù)組均有一定表達,模型組表達明顯高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01),阻斷組GR表達低于SPS組(P<0.01)。
　　 3、RT-PCR分析海馬GR mRNA和下丘腦CRF mRN

13、A表達
　　 正常對照組和假手術(shù)組GR和CRFmRNA表達沒有區(qū)別,但模型組二者表達顯著增高(P<0.01),這種增高可以被WAY100635阻斷(P<0.05)。
　　 三、PTSD大鼠前額皮質(zhì)磷酸化細胞外信號轉(zhuǎn)導激酶的變化
　　 1、pERK1/2免疫組化染色
　　 pERK1/2蛋白定位在胞漿,陽性細胞顯示棕黃色。對照組陽性細胞的OD值比較小,SPS組大鼠明顯增高(P<0.01),PD98059+S

14、PS組大鼠陽性細胞OD值明顯比SPS組小(P<0.01)。
　　 2、pERK1/2 Western blotting分析
　　 SPS組大鼠pERK1/2相對表達明顯增高(P<0.01),PD98059+SPS組大鼠pERK1/2比SPS組表達弱(P<0.01)。結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。
　　 3、RT-PCR分析結(jié)果
　　 正常大鼠c-fos mRNA有低量表達。SPS大鼠表達增高,注入PD9805