缺營養(yǎng)誘導(dǎo)的自噬和端粒酶在肝癌細胞對化療藥物不敏感中作用的研究.pdf

1、肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見的惡性腫瘤之一，且呈逐年上升之勢，肝癌的治療目前仍是以手術(shù)為主的綜合治療，但中晚期患者常失去手術(shù)機會。由于肝癌對化療的不敏感，所以肝癌的化療總體效果不佳。因此研究肝癌對化療的不敏感性對提高肝癌的療效以及提高病人生存率有很重要的意義。雖然目前對肝癌的耐藥機制研究較多，但確切的機制仍不清楚。新近的研究表明，細胞自噬端粒酶可能和腫瘤的耐藥有關(guān)。 目的：

2、研究缺營養(yǎng)誘導(dǎo)的自噬和端粒酶在肝癌細胞對化療藥物不敏感中的作用。 本實驗主要由以下兩大部分組成： 第一部分，缺營養(yǎng)誘導(dǎo)的自噬在肝癌對化療不敏感中的作用 將肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、SMMC7721)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測細胞活性，用AnnxinV/PI雙染色來檢測細胞死亡，以全營養(yǎng)和缺營養(yǎng)情況下未用藥的對照組

3、為基準，比較不同營養(yǎng)情況下肝癌細胞在化療藥作用下的死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺營養(yǎng)情況下肝癌細胞對化療藥物的敏感性降低。由于缺血缺營養(yǎng)是細胞發(fā)生自噬的天然誘導(dǎo)劑，新近的研究表明自噬與腫瘤對化療不敏感有關(guān)，這些研究提示我們自噬可能參與了肝癌細胞對化療的不敏感，因此我們進一步研究肝細胞癌缺營養(yǎng)是否誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。 將肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、SMMC7721)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，應(yīng)用電子透射顯

4、微鏡檢測自噬小體，realtime PCR.檢測和比較不同營養(yǎng)情況下自噬基因(LC3、ATG5、ATG7、DRAM、beclinl等)表達。同時我們也利用轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒檢測和比較不同營養(yǎng)情況下肝癌細胞成點狀綠色熒光的數(shù)量；結(jié)果表明，肝癌細胞在缺營養(yǎng)情況下自噬小體的形成數(shù)量要高于全營養(yǎng)情況，同時成點狀綠色熒光的數(shù)量也明顯增多。這些結(jié)果表明肝細胞癌在缺營養(yǎng)情況下誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。 對肝癌自噬的進一步的研究還證實抑制自噬增加腫

5、瘤細胞在缺營養(yǎng)情況下的死亡率和對化療的敏感性。將肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、SMMC7721)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，預(yù)先應(yīng)用自噬抑制劑(3MA、LN294002)作用2h，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測細胞活性，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，用AnnxinV/PI雙染色以及DAPI染色來檢測細胞凋亡，比較和觀察在全營養(yǎng)、缺營養(yǎng)及缺營養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫

6、瘤細胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抑制自噬和缺營養(yǎng)的情況下，腫瘤細胞死亡增加，同時腫瘤細胞對化療藥物的敏感性也增加。 綜合上面的實驗結(jié)果，我們的研究表明自噬不但是肝癌細胞在缺營養(yǎng)情況下的生存機制之一，同時也有助于肝癌細胞抵抗化療的作用。但是目前關(guān)于自噬抵抗化療的具體機制還不是很清楚。自噬是體內(nèi)唯一的一個降解細胞器的途徑，所以大部分的研究認為自噬可能通過降解受損的線粒體，防止促凋亡因子如細胞色素和凋亡誘導(dǎo)因

7、子(AIF)的擴散，以幫助細胞逃逸凋亡。同時研究也顯示p53在腫瘤細胞的自噬發(fā)生過程起到很重要的作用。因此在p53野生型的肝癌細胞中我們關(guān)注線粒體和p53在自噬誘導(dǎo)肝癌細胞對化療藥物不敏感中的作用。 將肝癌細胞系培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，抽取RNA，應(yīng)用realtime PCR檢測和比較不同營養(yǎng)情況下線粒體基因(Nd2、Nmel)的表達。同時將p53野生型的肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721

8、)預(yù)先應(yīng)用p53抑制劑PFT-a作用1h，然后繼續(xù)培養(yǎng)在全營養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中24h。應(yīng)用電子透射顯微鏡檢測自噬小體的形成。同時我們也利用轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒檢測和比較p53抑制和未抑制情況下肝癌細胞成點狀綠色熒光的數(shù)量；結(jié)果表明，在缺營養(yǎng)情況下線粒體基因Nd2表達降低，表明線粒體數(shù)量減少：同時肝癌細胞在缺營養(yǎng)聯(lián)合p53抑制情況下自噬小體的形成數(shù)量低于p53未抑制情況，同時成點狀綠色熒光的數(shù)量也明顯減少。進

9、一步的研究還顯示在p53抑制聯(lián)合缺營養(yǎng)的情況下，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理24h，利用cck8法檢測細胞活性，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，用AnnxinV/PI雙染色以及DAPI染色來檢測細胞凋亡，比較和觀察在全營養(yǎng)、缺營養(yǎng)及缺營養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫瘤細胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抑制p53和缺營養(yǎng)的情況下，腫瘤細胞死亡增加，同時腫瘤細胞對化療藥物的敏感性也增加。這個結(jié)果表明線粒體的減少以

10、及p53的激活可能參與了肝癌對化療的不敏感。 第二部分，端粒酶在肝癌對化療不敏感中的作用 端粒酶重新激活是癌變細胞一個帶有普遍性意義的生物學(xué)標志，被認為是細胞癌變的一個重要細胞生物學(xué)異常事件，是細胞永生化及腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。近年來大量的研究資料表明，端粒酶除了有延長端粒長度的功能外還有抗凋亡作用，由于大多數(shù)化療藥物作用于腫瘤細胞是通過凋亡而實現(xiàn)，因此端粒酶的抗凋亡效應(yīng)在腫瘤對化療的不敏感性中的作用愈來愈引起大家的關(guān)注。

11、 在這一部分研究中我們首先發(fā)現(xiàn)低濃度化療藥物順鉑誘導(dǎo)肝癌細胞端粒酶上調(diào)和hTERT表達的升高。肝癌細胞7721培養(yǎng)在含不同濃度化療藥物順鉑的培養(yǎng)基中24h，抽提蛋白，利用TRAP法(端粒重復(fù)擴增法)檢測和比較不同濃度順鉑作用的SMMC7721細胞的端粒酶活性。Western blot和RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-PCR)方法檢測和比較細胞中hTERT的表達情況；同時我們也利用已構(gòu)建好的hTERT基因啟動子熒光素報告基因(hTERT p

12、romoter-luciferase reporter system)系統(tǒng)來檢測和比較SMMC7721細胞的端粒酶hTERT基因啟動子活性；結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)不同濃度化療藥物順鉑對肝癌細胞SMMC7721其端粒酶的活性和hTERT基因的表達水平的誘導(dǎo)有一個劑量依賴的關(guān)系。而且研究結(jié)果還表明藥物誘導(dǎo)肝癌細胞端粒酶的上調(diào)，其上調(diào)可能是由于端粒酶hTERT組分表達量的增加所致。端粒酶hTERT基因的表達是受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。進一步深入的研究發(fā)現(xiàn)低

13、濃度順鉑能上調(diào)NF-κB活性以及p65組分的表達，抑制NF-κB會損害低濃度順鉑對端粒酶hTERT基因表達的上調(diào)作用。這表明轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與了低濃度順鉑對端粒酶hTERT基因表達的上調(diào)作用。 在本實驗室以前進行的肝癌端粒酶相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)HCC的端粒酶陽性率為85％，明顯高于癌旁組織、肝硬變組織及慢性肝炎組織，而正常肝臟組織不表達端粒酶活性，認為端粒酶的表達可能在HCC的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用。由于端粒酶具有抗凋亡效應(yīng)

14、，同時結(jié)合肝癌對化療的不敏感，因此我們猜想低濃度順鉑誘導(dǎo)的端粒酶的升高參與肝癌對化療的不敏感。肝癌細胞7721培養(yǎng)在含低濃度 (1μg/ml)化療藥物順鉑的培養(yǎng)基中24h，隨后用5-FU(65μg/ml)和表柔比星(1μg/ml)分別處理誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的7721細胞24小時；在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，Western blot檢測PARP來指示細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過的肝癌細胞7721的存活率比未誘導(dǎo)的高，細胞出現(xiàn)變小、

15、變圓和透亮等形態(tài)變化的較少；同時PARP表達減少說明凋亡率減少。這些結(jié)果提示經(jīng)低濃度順鉑誘導(dǎo)過的SMMC7721細胞比未誘導(dǎo)過的細胞顯示出了更低的化療藥物的敏感性。近一步的實驗還證實抑制hTERT的表達提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。在體外的研究中發(fā)現(xiàn)針對hTERT的siRNA能明顯抑制hTERT蛋白的表達和hTERT啟動子的活性：抑制端粒酶hTERT能顯著提高腫瘤細胞對化療藥物5-FU、表柔比星和順鉑的敏感性，表現(xiàn)在細胞hTERT抑制

16、后，在藥物作用下細胞死亡增加，DAPI染色顯示核固縮、碎裂增多。接著我們在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，我們將肝癌細胞系7721和HepG2種植BALB/c裸鼠皮下成瘤，然后直接將腺病毒注射到腫瘤內(nèi)，并聯(lián)合腹腔注射順鉑，每隔5天一次，共4次，結(jié)果顯示聯(lián)合hTERT抑制和順鉑作用能有效的抑制種植瘤的生長。 綜上所述，本課題得出以下結(jié)論： 1、營養(yǎng)缺乏能誘導(dǎo)肝癌細胞激活自噬，自噬能誘導(dǎo)肝癌細胞對化療不敏感，抑制自噬能提高腫瘤細

17、胞在缺營養(yǎng)情況下的死亡率以及對化療的敏感性。 2、p53參與了營養(yǎng)缺乏情況下肝癌細胞自噬的激活，抑制p53能提高腫瘤細胞在營養(yǎng)缺乏情況下的死亡率以及對化療的敏感性。 3、低濃度的順鉑能誘導(dǎo)肝癌細胞端粒酶上調(diào)和hTERT表達的升高，這種升高受到 NF-κB的調(diào)控。 4、低濃度順鉑能誘導(dǎo)肝癌細胞對化療藥物的不敏感。抑制端粒酶hTERT的表達，能提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性，而能明顯抑制肝癌細胞在體內(nèi)的生長