聯(lián)合NK4基因和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)基因治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌是臨床上難治性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。外科手術(shù)是現(xiàn)階段胰腺癌最為有效的治療方式，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且70％-90％的病人確診時(shí)已喪失根治手術(shù)的時(shí)機(jī)，5年生存率依然小于5％。因此，積極尋求新的治療措施，提高胰腺癌的綜合治療水平是亟待解決的重要課題。 隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的不斷深入和交叉滲透，以免疫學(xué)原理為基礎(chǔ)、分子生物學(xué)技術(shù)為方法建立起來(lái)的腫瘤免疫基因治療（Immunog

2、ene therapy）為胰腺癌的治療提供了新的希望。然而現(xiàn)已報(bào)道的大多數(shù)腫瘤臨床基因治療方案中，絕大多數(shù)方案采用單一抗腫瘤的目的基因，而單基因治療腫瘤療效大多不甚理想，局限性大，相比之下，多基因聯(lián)合治療具有更大的合理性與優(yōu)越性，是腫瘤基因治療發(fā)展的必然方向。腫瘤發(fā)生及演進(jìn)是涉及多基因的復(fù)雜過(guò)程，而單一抗腫瘤基因作用不強(qiáng)大且有限，往往難以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此，利用兩種或多種基因聯(lián)合治療腫瘤，可充分發(fā)揮抗腫瘤基因間相互協(xié)同作用，顯著

3、增強(qiáng)抗腫瘤基因治療的效果。 NK4是1997年Date等用胰彈性蛋白酶消化裂解重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種HGF特異性拮抗劑，它由HGFα鏈N末端的447個(gè)氨基酸和4個(gè)Kringle區(qū)域所組成。HGF又稱分散因子（SF），是來(lái)源于間質(zhì)細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，在腫瘤細(xì)胞的粘附、基質(zhì)降解、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要的作用。HGF通過(guò)激活其特異性受體c-Met，從而促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲、基質(zhì)的降解和誘導(dǎo)新生血管形成，

4、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。研究表明HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與胰腺癌細(xì)胞的惡性度有關(guān)，胰腺癌細(xì)胞有c-Met的過(guò)度表達(dá)，而胰腺癌組織中的成纖維細(xì)胞則通過(guò)旁分泌的形式分泌HGF，誘導(dǎo)c-Met的酪氨酸磷酸化，刺激胰腺癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。HGF通過(guò)其受體c-Met的激活，在調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管形成中具有重要作用。因此NK4不僅是HGF的拮抗劑，也是血管生成的抑制劑。阻斷HGF/c-Met途徑和腫瘤血管生成可成為抗腫瘤治療的策略之一。

5、Kushibiki等研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NK4基能夠改變惡性胰腺癌的生物學(xué)行為，抑制胰腺癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。Murakami等的實(shí)驗(yàn)在裸鼠模型上發(fā)現(xiàn)NK4能夠抑制胰腺癌的肝轉(zhuǎn)移，此外，研究還發(fā)現(xiàn)NK4是血管形成的抑制劑，可以抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)的血管形成作用。 單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是趨化因子超家族CC亞族中對(duì)單核細(xì)胞趨化活性最強(qiáng)的趨化因子，MCP-1在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)

6、在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。MCP-1能夠通過(guò)T細(xì)胞依賴的和非T細(xì)胞依賴的方式來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Monti等的研究發(fā)現(xiàn)MCP-1在胰腺癌的演進(jìn)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，他們發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者M(jìn)CP-1的水平明顯高于正常人，而且血漿中MCP-1水平高的胰腺癌手術(shù)切除患者比水平低的患者有更好的預(yù)后。血漿MCP-1的濃度和腫瘤巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)，而與腫瘤的增殖活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞在腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)（intra-tumora

7、l infiltration）來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的。 本課題以制備的分別攜帶NK4和MCP-1基因的兩種重組腺病毒為基礎(chǔ)，在體外條件下用兩種重組腺病毒聯(lián)合感染胰腺癌細(xì)胞SW1990，使NK4基因及MCP-1基因在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并分泌NK4和MCP-1蛋白，探討聯(lián)合NK4和MCP-1基因治療胰腺癌的可行性及可能機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用聯(lián)合NK4和MCP-1基因治療胰腺癌奠定基礎(chǔ) 目的:擴(kuò)增、純化重組NK4及重組MCP-

8、1腺病毒，在體外條件下聯(lián)合兩種重組腺病毒感染胰腺癌細(xì)胞SW1990，將NK4基因及MCP-1基因?qū)胍认侔┘?xì)胞，使其表達(dá)并分泌NK4和MCP-1蛋白。檢測(cè)基因表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響探討聯(lián)合NK4和MCP-1基因基因治療胰腺癌的可行性及可能機(jī)制。為進(jìn)一步臨床應(yīng)用聯(lián)合NK4和MCP-1基因治療胰腺癌奠定基礎(chǔ)。 方法:1.將NK4及MCP-1重組腺病毒分別感染HEK293包裝細(xì)胞制備重組腺病毒，純化并通過(guò)GFP法測(cè)定病毒的

9、滴度。2.用不同MOI的重組腺病毒懸液感染人胰腺癌SW1990細(xì)胞，判斷不同滴度腺病毒對(duì)胰腺癌細(xì)胞的感染效率。3.以合適滴度的重組NK4與MCP-1腺病毒顆粒分別及聯(lián)合感染SW1990胰腺癌細(xì)胞，熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒感染SW1990胰腺癌細(xì)胞后NK4基因和MCP-1基因的mRNA表達(dá)水平；4.應(yīng)用ELISA檢測(cè)病毒感染SW1990胰腺癌細(xì)胞后MCP-1蛋白的表達(dá)5.MTT確定NK4聯(lián)合MCP-1重組腺病毒的感染對(duì)SW1990細(xì)胞

10、和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果:一定濃度的Ad-Track、Ad-NK4、Ad-MCP-1能夠100％感染HEK293細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)成功擴(kuò)增。當(dāng)采用的MOI小于80 efu/細(xì)胞時(shí)，腺病毒對(duì)SW1990細(xì)胞的感染效率隨病毒滴度的增加而提高。MOI為60 efu/細(xì)胞時(shí)，SW1990細(xì)胞的感染效率接近100％。熒光定量RT-PCR檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)，以病毒感染24小時(shí)基因表達(dá)水平為100％，MCP-1及NK4的表達(dá)在第5天達(dá)

11、到最高，分別為24小時(shí)表達(dá)量的7.46倍和7.57倍隨后開(kāi)始下降，第9天的表達(dá)水平只有24小時(shí)表達(dá)量的1.6倍左右。到12天時(shí)基因的表達(dá)水平只剩下約1/4。MCP-1及NK4兩種病毒聯(lián)合感染SW1990細(xì)胞，每個(gè)基因的表達(dá)水平比單一感染時(shí)下降約30％。病毒感染后連續(xù)6天繪制SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，三種感染模式下的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與對(duì)照的母細(xì)胞沒(méi)有顯著差異；單一重組NK4腺病毒單獨(dú)及聯(lián)合重組MCP-1腺病毒感染SW1990細(xì)胞后的上清對(duì)血

12、管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)都有抑制作用。 結(jié)論:腺病毒介導(dǎo)的Ad-NK4、Ad-MCP-1能有效地感染SW1990細(xì)胞并表達(dá)高水平的NK4和MCP-1基因并能有效分泌到細(xì)胞外，峰值維持在3-7天左右。腺病毒感染介導(dǎo)的NK4及MCP-1基因的表及達(dá)在體外對(duì)SW1990生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。但Ad-NK4感染胰腺癌細(xì)胞后表達(dá)的NK4明顯抑制了HGF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明在胰腺癌中NK4可能主要通過(guò)抑制腫瘤血管的生成發(fā)揮抑瘤的作用。MCP-1