草酸和草酸鈣晶體誘導(dǎo)腎臟NADPH氧化酶相關(guān)性氧化應(yīng)激損傷的研究.pdf

1、目的：建立高草酸尿癥大鼠模型，觀察高草酸尿和草酸鈣晶體沉積導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激(OS)損傷的情況；觀察NADPH氧化酶在高草酸尿癥大鼠腎臟中的表達和作用；觀察血管緊張素II(Ang II)和NADPH氧化酶在高草酸尿癥大鼠腎臟氧化應(yīng)激(OS)形成中的相互作用；觀察在低劑量誘石劑誘導(dǎo)下腎臟線粒體和NADPH氧化酶的改變情況，探討腎臟ROS的主要來源，同時觀察牛磺酸對腎臟的保護作用；觀察草酸鈣晶體刺激下巨噬細胞NADPH酶的表達和活性變化及其作

2、用。 方法：高草酸尿癥模型通過給予雄性SD大鼠(190-210g)自由飲用含0.8％乙二醇的飲水4周而誘導(dǎo)建立。動物隨機分2個組(n=8)：A，空白組，飲用正常飲水；B，高草酸尿癥組，飲用含0.8％乙二醇的飲水。四周后收集大鼠24h尿液，分別檢測尿草酸、尿鈣、尿肌酐、尿H2O2、尿8-IP，采血測血清肌酐，取腎臟組織進行病理分析；采用0.8％乙二醇飲水法誘導(dǎo)建立高草酸尿癥大鼠模型，檢測各組大鼠尿液、腎組織中的氧化應(yīng)激(OS)指標

3、水平，免疫組化觀察NADPH氧化酶亞基p47phox蛋白在腎臟中的表達位置，RT-PCR檢測腎組織NADPH氧化酶亞基p47phox、gp91phox、Nox-1，p22phox，Nox-4 mRNA的表達水平，免疫印跡檢測腎組織p47phox蛋白的表達水平；采用0.8％乙二醇飲水法誘導(dǎo)建立高草酸尿癥大鼠模型，檢測大鼠尿液、腎組織中的氧化應(yīng)激(OS)指標，放免法檢測腎組織Ang II的含量，免疫組化法觀察p47phox蛋白在腎臟中的表達

4、位置，RT-PCR法檢測腎組織p47phox mRNA的表達水平；采用定量灌胃2.5％乙二醇+2.5％氯化銨(4ml/d，分2次給予)并控制飲水4周誘導(dǎo)建立草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型，透射電鏡下觀察腎小管上皮的超微病理改變，免疫組化和RT-PCR觀察NADPH氧化酶亞基p47phox在腎臟中的定位和基因表達水平；同時檢測腎組織中血管緊張素II的水平；建立鼠巨噬細胞株體外培養(yǎng)體系，在體系中加入一水草酸鈣(COM)晶體共同培養(yǎng)，并使用NADPH氧

5、化酶特異抑制劑夾竹桃麻素進行干預(yù)處理，采用比色法檢測各組細胞培養(yǎng)基中MDA、LDH的水平，熒光比色法檢測各組細胞內(nèi)ROS水平，比色法檢測各組細胞NADPH氧化酶的活性，免疫印跡檢測各組巨噬細胞表達NADPH氧化酶亞基p47phox蛋白的水平。 結(jié)果：與空白組比較，高草酸尿癥組大鼠尿草酸排泄量明顯增多，尿鈣減少，尿8-IP和H2O2增多，而尿肌酐排泄量減少，肌酐清除率下降；腎臟病理分析示腎組織中大量含鈣結(jié)晶體沉積，腎小管腔擴大和上

6、皮損傷，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，腎組織CD68、TGF-β、α-SMA的表達均明顯增強；免疫組化證實p47phox在各組大鼠腎臟中均有表達，表達部位在腎小球、集合管、遠曲和近曲小管、髓袢等。與空白組比較，誘導(dǎo)高草酸尿癥后大鼠腎臟p47phox、gp91phox和Nox-1 mRNA表達顯著增多，p22phox，Nox-4 mRNA的表達未發(fā)現(xiàn)明顯變化，p47phox蛋白表達也明顯增多，伴腎臟OS損傷；誘導(dǎo)高草酸尿癥的同時使用夾竹桃麻素則

7、腎臟表達p47phox、Nox-1 mRNA及p47phox蛋白減少，但gp91phox mRNA的表達未明顯減少，而腎臟的OS損傷程度減輕，但仍高于對照組水平；p47phox在各組大鼠腎臟中都有廣泛表達，表達部位包括腎皮質(zhì)、內(nèi)髓、外髓。與A組比較，B組尿液8-IP明顯增多，腎組織SOD活性降低，腎組織AngⅡ含量增多，p47phox mRNA在腎組織中的表達水平也明顯增多。使用夾竹桃麻素(C組)和氯沙坦(E組)均可抑制腎組織p47ph

8、ox mRNA的表達，同時腎臟的OS程度減輕；與空白組比較，使用誘石劑誘導(dǎo)結(jié)石后大鼠尿8-IP顯著增加，肌酐清除率降低，腎臟/體重比值增加，腎組織線粒體SOD、GSH-Px活性下降伴線粒體損傷，腎臟內(nèi)廣泛結(jié)晶體沉積并上皮損傷表現(xiàn)；同時使用?；撬徇M行干預(yù)則尿8-IP生成減少，肌酐清除率增加，腎臟/體重比值減少，腎組織線粒體SOD、GSH-Px活性增加而線粒體損傷程度減輕，腎小管上皮病理損傷情況改善。但是，腎組織p47phox mRNA的表

9、達水平，以及腎組織勻漿液血管緊張素II的水平，在各組中均無明顯的差異；免疫印記檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組比較，B組細胞表達p47phox蛋白明顯增多，使用夾竹桃麻素(C組)則可抑制COM刺激下巨噬細胞p47phox蛋白的表達水平。 結(jié)論：采用0.8％乙二醇的飲水法成功誘導(dǎo)建立高草酸尿癥大鼠模型，同時觀察到高草酸尿癥大鼠腎臟OS發(fā)展和腎臟損傷出現(xiàn)；NADPH氧化酶是高草酸尿癥大鼠腎臟中ROS形成的來源之一；在高草酸尿癥大鼠模型中，腎臟p