雞miR-2954超表達載體的構建及其性腺發(fā)育相關靶基因的研究.pdf

1、禽類與哺乳動物均屬于遺傳性別決定，但與哺乳動物不同，禽類的性別決定機制還不確定，上游性別決定因子還有待于進一步探尋。研究表明在轉錄后起重要調控作用的miRNAs在動物性腺發(fā)育過程有重要作用，本課題組擬從miRNA水平尋找與雞性別決定及早期性腺發(fā)育相關的上游調控因子。miR-2954是位于禽類Z染色體上的miRNA，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其在雄性性腺及其他組織中的表達量顯著高于雌性，與先前報道的在其他禽類中的研究結果相似，這提示了miR-2

2、954可能作為一個細胞自主決定因子在雞早期性別決定及性腺發(fā)育中起調控作用。本研究首先構建了miR-2954超表達載體，并結合基因的雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了miR-2954與性腺發(fā)育及功能相關靶基因的調控關系，為進一步確定及研究miR-2954在雞早期性腺發(fā)育中的功能奠定基礎。本研究的實驗結果如下:
　　1.制備了不同性別原代雞胚成纖維細胞(CEF)，通過定量PCR檢測miR-2954在不同CEF細胞及商品化DF1細胞中的表達量，結

3、果顯示miR-2954在雄性CEF細胞中的表達量最高，并極顯著地高于雌性和混樣（雌雄等量混合）CEF及商品化DF1細胞，這與miR-2954雄性高表達特性相符;且結果表明本室的商業(yè)化DF1細胞適用于后續(xù)的miR-2954超表達載體效果檢測及靶基因驗證研究。
　　2.構建了PSIN-2954、PSIN-eGFP-2954和PSIN-eGFP三種表達載體，通過序列測定和轉染細胞后熒光觀察初步確定其效果。定量PCR檢測結果顯示miR-2

4、954在轉染了PSIN-2954和PSIN-eGFP-2954載體的細胞中表達量均顯著提高，這表明miR-2954超表達載體構建成功。
　　3.轉染PSIN-2954載體后通過PI染色法檢測miR-2954對DF1細胞周期的影響。結果顯示:轉染miR-2954組G1期的細胞比例呈極顯著降低，而S期和G2期的細胞則極顯著升高，這表明miR-2954的超表達可促進細胞增殖。
　　4.根據(jù)雞轉錄組的mRNA(包括5'UTR、CDS

5、和3'UTR)與miR-2954序列的匹配情況與功能分析，篩選出四個與雞性腺發(fā)育及功能相關的基因AMH、DMRT1、SF1及VLDL作為miR-2954的候選靶基因，并成功的構建了靶序列的熒光素酶報告重組載體。
　　5.候選靶基因(AMH、DMRT1、SF1和VLDL)的雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果顯示，miR-2954可顯著或極顯著地降低SF1和VLDL-CDS雙熒光素酶的活性，而AMH和DMRT1-CDS雙熒光素酶活性無明顯變化