當(dāng)歸多糖對(duì)巨核細(xì)胞造血的影響.pdf

1、目的：血小板減少癥(衄ombocytopenia)是臨床常見的病癥，除了特發(fā)性血小板減少性紫癜外，還常見于再生障礙性貧血、化療、放療和骨髓移植的病人，嚴(yán)重影響此類疾病的治療效果。傳統(tǒng)中藥用于治療貧血、血小板減少癥及骨髓抑制等疾病已有數(shù)百年歷史，實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)證明用復(fù)方中草藥治療血小板減少癥是安全有效的。傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血的功效，現(xiàn)代研究認(rèn)為，當(dāng)歸補(bǔ)血的機(jī)理可能與其成分一當(dāng)歸多糖(APS)促進(jìn)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖分化有關(guān)，但APS對(duì)巨

2、核細(xì)胞／血小板造血的影響作用及具體的信號(hào)通路尚不清楚。目前國(guó)內(nèi)外還沒有用純化的中草藥成分研究巨核細(xì)胞造血的報(bào)道，純化的APS尚未用于治療血小板減少癥。本實(shí)驗(yàn)以人巨核細(xì)胞系M一07e為研究對(duì)象，用純化的APS處理細(xì)胞后，觀察APS對(duì)巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，并從分子水平上探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步應(yīng)用APS治療血小板減少癥提供現(xiàn)代科學(xué)理論依據(jù)。 方法：以巨核系細(xì)胞M—07e為研究對(duì)象，檢測(cè)APS對(duì)M．07e細(xì)胞增殖和凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)

3、分組為：正常培養(yǎng)組(IMDM+10％FBS)、對(duì)照組(IMDM)、APS組(IMDM+100μg/mLAPS)、PDGF組(IMDM+50ng/mLPDGF)和TP0組(IMDM+50ng/mLTPO)。在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組下列指標(biāo)：①24、48、72小時(shí)分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)活細(xì)胞比率及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；②用流式細(xì)胞儀分別以AnnexinV、Caspase一3、JC一1三種方法測(cè)定細(xì)胞凋亡率；③以Westernb

4、lot的方法檢測(cè)給予APS(100μg／mL)O、8、16、24、48小時(shí)Bax、Bcl．2及Bax/Bcl一2的變化情況。 結(jié)果：①APS對(duì)巨核系細(xì)胞M—07e增殖的影響：細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)細(xì)胞活率：在觀察周期內(nèi)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞均有增殖(初始接種細(xì)胞密度為1．0×105／mL)，APS組細(xì)胞數(shù)24、48、72小時(shí)分另0增力口至(1．73土O．33)×1O5／mL(P=0．1O，vs．Control)、(2．

5、51士O．52)×105／mL(P=O．011，vs．Contr01)及(4．76±0．53)×105／mL(P=0.0011，vs．Contr01)；活細(xì)胞比率分別為94％、90％和85％，都顯著高于對(duì)照組(P

6、AnnexinV：APS、PDGF或TP0存在時(shí)，M—07e培養(yǎng)72小時(shí)，各組中早期凋亡細(xì)胞[AnnexinV(AnV)+PI-]的比例分別為(10．4土3．0)％、(9．6±2．2)％和(9．6±3．1)％，與對(duì)照組(15．3士3．8)％比較P值分別為O．017、O．026和0．019，都有顯著性差異；培養(yǎng)72小時(shí)，全部死細(xì)胞(AnV+PI-和AnV+PI+兩群細(xì)胞之和)顯著降低，分別為(19．4士7．6)％、(21．4±7．3)％和

7、(18．8士8．O)％，與對(duì)照組(34．3土5．5)％比較P值分別為0.0046、O．026和O．016，都有顯著性差異(n=7)。(b)Caspase一3：APS、PDGF和TPO組活化的Caspase一3較對(duì)照組明顯減少，分別為(12．3士5．2)％、(12．4士6．3)％和(13．7±8．3)％，和對(duì)照組(18．9±6．1)％比較P值分別為0．017、0．025和0．12(n=5)。(c)JC—l結(jié)果顯示，三個(gè)組全部死亡細(xì)胞(R1

8、+R2)分別為(23．6±6．7)％、(28±10．1)％和(28±9．0)％，與對(duì)照組(39．5士11．9)％比較P值分別為O．0096、O．074和O．064(n=7)。⑧Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：當(dāng)給予APS0、8、16、24和48小時(shí)，Bax的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，48小時(shí)組僅為O小時(shí)組的O．28士O．086倍，Bcl一2的表達(dá)維持在1．0至1．15土0．32倍之間。48小時(shí)內(nèi)，Bax/Bcl一2的比率從1

9、．02土O．40降至O．27士O．092。 結(jié)論：①APS具有促進(jìn)M一07e細(xì)胞增殖的作用，且APS的這種促進(jìn)巨核細(xì)胞生長(zhǎng)的作用與經(jīng)典的巨核細(xì)胞／血小板生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子PDGF和TP0類似。②APS能夠抵抗無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的M一07e細(xì)胞凋亡，且APS的抗凋亡作用與PDGF和TPO類似，甚至強(qiáng)于二者。③APS的抗凋亡作用機(jī)制一方面可能是通過減少Caspase一3的活化和穩(wěn)定線粒體膜而部分實(shí)現(xiàn)的；另一方面可能是APS降低無血清培養(yǎng)的M-