應(yīng)用支撐向量模型預(yù)測(cè)晚期鼻咽癌預(yù)后及在鼻咽癌細(xì)胞中靶向Aurora-A激酶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌(NPC)作為與EB病毒感染密切相關(guān)的頭頸部腫瘤對(duì)放射治療敏感，使得放療成為未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的首選根治性治療手段。雖然近年來(lái)放射治療技術(shù)的進(jìn)步、化療及靶點(diǎn)藥物等綜合治療方法的應(yīng)用，在一定程度上提高了腫瘤的局部控制率，減輕了周圍正常組織的不良放療反應(yīng)，但是患者5年生存率仍然徘徊在60％左右，局部晚期患者甚至更低。本研究分為六個(gè)部分：
　　 第一章：25種分子標(biāo)記物在鼻咽癌中的表達(dá)檢測(cè)及數(shù)據(jù)預(yù)處理。
　　 目的：檢測(cè)2

2、5種分子標(biāo)記物在局部晚期鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，通過(guò)半定量評(píng)分量化各分子在組織中的表達(dá)水平，并對(duì)各分子的表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系進(jìn)行初步探討。
　　 方法：通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了HIF-1α，Aurora-A，Beclin1，EZH2，E-Cadherin，N-Cadherin,CENP-H，cyclin Dl，Stathmin,β-catenin,Survivin，MMP-2，c-Met，Ki-67，P21，CDC2，Bcl

3、-2，COX-2，nm23-H1，Bax，Snail，Twist,ERK，P27及TIMP-2等25種分子標(biāo)記物的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：ROC曲線分析結(jié)果顯示：在誘導(dǎo)+放療組患者(IC/RT)，Aurora-A、Beclin1、Bcl-2、MMP-2、CENP-H、Stathmin、N-Cadherin、Bax、P27及TIMP-2對(duì)患者治療后5年的生存狀態(tài)(生存VS死亡)具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值;在誘導(dǎo)+同期放化療組(IC/CRT

4、)患者，Aurora-A、Beclin1、HIF-1α、Bcl-2及c-Met對(duì)患者治療后5年的生存狀態(tài)具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　 結(jié)論：本部分研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)結(jié)合量化評(píng)分，并通過(guò)ROC曲線及Kaplan-Meier生存分析初步鑒別出Aurora-A、Bcl-2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2及HIF-1α等分子對(duì)局部晚期鼻咽癌患者具有較高的生存狀態(tài)預(yù)測(cè)能力，這些預(yù)后分子將為隨后SVM模型的建立提供

5、數(shù)模基礎(chǔ)。
　　 第二章：局部晚期鼻咽癌患者5年生存狀態(tài)SVM預(yù)后模型的建立。
　　 目的：設(shè)計(jì)SVM個(gè)體化預(yù)后預(yù)測(cè)模型，并測(cè)試其對(duì)局部晚期鼻咽癌患者治療后5年生存狀態(tài)的預(yù)測(cè)能力。
　　 方法：選取25種分子標(biāo)記物評(píng)分均齊全的120例(IC/RT及IC/CRT各60例)患者作為研究對(duì)象。將第一章中篩選出來(lái)的Aurora-A、Bcl-2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2、HIF-1α、COX2、患者

6、的血清學(xué)指標(biāo)VCA-IgA及EA-IgA等共計(jì)10種因子納入SVM模型設(shè)計(jì)，并分別針對(duì)IC/RT組患者、IC/CRT組患者及所有患者(IC/RT+IC/CRT)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的SVM預(yù)后預(yù)測(cè)模型-SVM1、SVM2及SVM3。
　　 結(jié)果：測(cè)試集測(cè)試結(jié)果表明：SVM1模型的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為67.6％，陰性預(yù)測(cè)值為85.7％，敏感性為81.3％，特異性為87.0％，總準(zhǔn)確率為85.5％。
　　 結(jié)論：基于Aurora-A、Bcl-

7、2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2、HIF-1α、VCA-IgA及EA-IgA等分子設(shè)計(jì)的SVM預(yù)后預(yù)測(cè)模型對(duì)IC/RT、IC/CRT及兩組患者的5年生存狀態(tài)具有較高的個(gè)體化預(yù)測(cè)能力。
　　 第三章：Aurora-A激酶在鼻咽癌中的表達(dá)水平及其臨床意義。
　　 目的：明確Aurora-A激酶在鼻咽癌中的表達(dá)水平，分析其與患者各臨床指標(biāo)，尤其是與預(yù)后指標(biāo)間的關(guān)系，為隨后基于此的靶向治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

8、
　　 方法：所需腫瘤組織來(lái)自于本研究第一部分第一章患者，利用免疫組織化學(xué)染色的方法我們檢測(cè)了145例局部晚期鼻咽癌患者組織中Aurora-A激酶的表達(dá)水平。同時(shí)，應(yīng)用Western Blot及RT-PCR我們檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞株，8例患者鼻咽癌及癌旁正常組織中Aurora-A的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：組織及細(xì)胞水平研究表明，Aurora-A蛋白及mRNA在鼻咽癌組織及細(xì)胞水平表達(dá)顯著高于正常鼻咽上皮，Aurora-A在I

9、C/RT及IC/CRT患者組織中的高表達(dá)與患者較短的總生存時(shí)間(OS)、無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)及無(wú)轉(zhuǎn)移生存時(shí)間(DMFS)顯著相關(guān)，Aurora-A蛋白高表達(dá)是局部晚期鼻咽癌患者OS，PFS及DMFS的負(fù)性預(yù)后因子。
　　 結(jié)論：Aurora-A蛋白及mRNA在鼻咽癌組織及細(xì)胞水平表達(dá)顯著高于正常鼻咽上皮，其高表達(dá)是局部晚期鼻咽癌患者OS，PFS及DMFS的負(fù)性預(yù)后因子。
　　 第四章：靶向Aurora-A抑制鼻咽癌細(xì)

10、胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡機(jī)制的研究。
　　 目的：通過(guò)應(yīng)用Aurora-A激酶的小分子抑制劑VX-680作用于鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，檢測(cè)VX-680對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡誘導(dǎo)作用，以明確該小分子抑制劑靶向治療鼻咽癌的作用。
　　 方法：將Aurora-A激酶的小分子抑制劑VX-680作用于鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株觀察其生長(zhǎng)抑制情況。首先，通過(guò)Western blot及免疫細(xì)胞熒光染色的方法檢測(cè)磷酸化Aurora-A激酶(Th

11、r288)的表達(dá)情況，明確VX-680對(duì)Aurora-A激酶活性的抑制作用；利用MTT法檢測(cè)VX-680對(duì)CNE-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用；通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)及Western blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3的表達(dá)情況，探討VX-680對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞是否具有凋亡誘導(dǎo)作用；最終明確特異性靶向抑制Aurora-A激酶對(duì)鼻咽癌的潛在治療價(jià)值。
　　 結(jié)果：VX-680對(duì)CNE-

12、2細(xì)胞的Aurora-A激酶的自身磷酸化抑制作用在較低濃度即可實(shí)現(xiàn)(1-2 nM)，而對(duì)Aurora-B激酶的天然底物Histone H3的磷酸化抑制作用則需較高濃度(5 nM)，可見VX-680對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的Aurora-A激酶具有選擇性抑制作用。VX-680可劑量依賴性地抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，究其機(jī)制在于VX-680一方面通過(guò)抑制Aurora-A使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，另一方面VX-680可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　

13、　 結(jié)論：VX-680對(duì)Aurora-A激酶具有更強(qiáng)烈的選擇性抑制作用。VX-680可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M并誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡雙重途徑抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。因而，VX-680有望成為鼻咽癌未來(lái)靶向治療中的新穎選擇。
　　 第五章：Aurora-A激酶促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。
　　 目的：明確Aurora-A激酶在鼻咽癌細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用，并闡明其分子機(jī)制。
　　 方法：通過(guò)基因轉(zhuǎn)染

14、及RNAi技術(shù)，構(gòu)建Aurora-A高表達(dá)、突變失活及低表達(dá)的CNE-2細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟—上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Methenchymal Transition,EMT)的標(biāo)志性分子(如胞膜E-Cadherin,β-catenin等)在Aurora-A高表達(dá)/低表達(dá)/突變失活時(shí)表達(dá)情況;通過(guò)Transwell小室檢測(cè)Aurora-A高表達(dá)/低表達(dá)/突變失活時(shí)，鼻咽癌細(xì)胞的體外遷徙轉(zhuǎn)移能力的改

15、變情況。
　　 結(jié)果：體外細(xì)胞水平研究表明：Aurora-A通過(guò)MAPK1/2信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。Western blot檢測(cè)顯示MAPK1/2的表達(dá)水平與Aurora-A的表達(dá)水平呈正向相關(guān)，抑制MAPK1/2或Aurora-A可獲得相似的細(xì)胞表型，如：EMT逆轉(zhuǎn)、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移能力下降等。
　　 結(jié)論：與體內(nèi)研究結(jié)果相吻合的是：Aurora-A在體外水平可增強(qiáng)鼻咽癌CNE-2細(xì)

16、胞的EMT、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移能力。而Aurora-A上述惡性表型的獲得是通過(guò)MAPK1/2信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。該分子機(jī)制的闡明提示我們：靶向Aurora-A不僅可抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、誘導(dǎo)凋亡，而且可靶向逆轉(zhuǎn)細(xì)胞EMT表型、抑制細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，充分證明了Aurora-A在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的多維作用機(jī)制，進(jìn)一步表明靶向Aurora-A在鼻咽癌治療中的光明應(yīng)用前景。
　　 第六章：VX-680對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的放療增敏機(jī)制的研究。<

17、br>　　 目的：將VX-680與放射線同時(shí)作用于鼻咽癌細(xì)胞，探討VX-680是否具有放療增敏作用，并探討其分子機(jī)制，評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用潛能。
　　 方法：將VX-680與放射線同時(shí)處理鼻咽癌細(xì)胞，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察鼻咽癌細(xì)胞的存活特點(diǎn)，從而明確其對(duì)射線的敏感性改變情況；應(yīng)用Western blot及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及射線敏感蛋白的表達(dá)情況，闡明VX-680增加鼻咽癌細(xì)胞放射線敏感性的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：CN

18、E-2細(xì)胞經(jīng)1-2 nM的VX-680預(yù)處理24小時(shí)，另經(jīng)12天左右的生長(zhǎng)增殖后，平均有88.5％及85.2％的細(xì)胞存活；單獨(dú)予以1Gy劑量的放射線照射另經(jīng)12天左右的生長(zhǎng)增殖，約有89.3％的細(xì)胞存活；1Gy+1/2 nM VX-680聯(lián)合處理并經(jīng)12天左右的生長(zhǎng)增殖后，分別有68.8％及53.2％的細(xì)胞存活。
　　 結(jié)論：Aurora-A小分子抑制劑VX-680聯(lián)合放射線通過(guò)上調(diào)P53及P21的表達(dá)增加鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性