HGF對(duì)高氧致新生大鼠慢性肺疾病的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本課題以新生鼠及早產(chǎn)鼠為研究對(duì)象，更接近臨床實(shí)際，并同時(shí)進(jìn)行了在體及離體水平的研究，從以下幾方面闡明HGF對(duì)高氧致早產(chǎn)兒CLD保護(hù)作用及機(jī)制。 第一部分持續(xù)高氧暴露對(duì)新生大鼠肺組織病理、氧化、細(xì)胞凋亡以及HGF表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響及其相互關(guān)系第一章持續(xù)高濃度氧對(duì)新生大鼠肺病理組織學(xué)及氧化的動(dòng)態(tài)影響 目的：觀察持續(xù)吸入高濃度氧(高氧)對(duì)新生大鼠發(fā)育中肺的病理及肺組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化物變化，來探討高氧對(duì)新生鼠肺發(fā)育的影響。同時(shí)制備出新

2、生鼠高氧致CLD模型。 方法：新生SD大鼠生后12小時(shí)內(nèi)分別于90％以上氧(HO組)和空氣中(Air組)持續(xù)暴露，于3、7、14、21d，動(dòng)態(tài)觀察肺組織病理學(xué)改變和膠原染色面積的變化以及肺組織8-異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)含量。 結(jié)論： 1．高氧致新生鼠CLD的主要病理變化是肺泡發(fā)育障礙。 2．氧自由基可能參與了CLD的發(fā)病過程。 第二章 HGF在持續(xù)高氧暴露新生大鼠肺組織中的動(dòng)態(tài)

3、表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系 目的：動(dòng)態(tài)觀察高濃度氧(高氧)暴露新生鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和其受體cMet的表達(dá)變化以及兩者之間的相關(guān)關(guān)系，探討HGF在新生鼠CLD發(fā)病中的作用。 方法：新生SD大鼠出生后隨機(jī)分為Air組和HO組(90％氧氣)，分別于生后3、7、14、21d留取肺組織標(biāo)本。以TUNEL觀察細(xì)胞凋亡變化，透射電鏡觀察肺泡Ⅱ型細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化方法檢測(cè)HGF、cMet蛋白表達(dá)，R

4、T-PCR檢測(cè)HGF、cMet mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1．肺細(xì)胞凋亡參與了新生鼠CLD的發(fā)生、發(fā)展過程，同時(shí)也是導(dǎo)致高氧致CLD新生鼠肺泡發(fā)育障礙的原因之一。 2．HGF及其受體與新生鼠正常肺發(fā)育過程有關(guān)。 3．HGF參與了高氧肺損傷過程。 4．HGF可能與肺細(xì)胞的凋亡過程有關(guān)。 第二部分HGF對(duì)高氧暴露早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探討 第一章早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞的分離

5、純化及原代培養(yǎng)和高氧細(xì)胞損傷模型的建立 目的：探討建立可靠的早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上建立肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞高濃度氧(高氧)損傷模型，為從細(xì)胞水平研究高氧肺損傷的發(fā)病修復(fù)機(jī)制，進(jìn)一步防治早產(chǎn)兒CLD奠定基礎(chǔ)。 方法：孕20d早產(chǎn)SD大鼠，引頸法處死，無菌條件下剖腹取出胎鼠，作為早產(chǎn)鼠。置無菌培養(yǎng)皿(無菌培養(yǎng)皿置于冰上)，引頸法處死，迅速取鼠肺，去除非肺組織，清洗肺組織塊，將肺組織塊剪至1 m

6、m<'3>大小先后用胰酶、DNAase及膠原酶消化成單細(xì)胞懸液，運(yùn)用反復(fù)貼壁及差速離心法純化出AEC Ⅱ。經(jīng)差速離心和反復(fù)貼壁法純化AECⅡ，進(jìn)行原代培養(yǎng)。用細(xì)胞角化蛋白、波形蛋白和表面活性物質(zhì)蛋白C免疫細(xì)胞化學(xué)染色或免疫熒光染色以及透射電鏡對(duì)純化的AEC Ⅱ進(jìn)行鑒定。純化后AEC Ⅱ用含15％FCS的DMEM培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞，此時(shí)貼附在瓶底接近融合狀態(tài)的AECⅡ用于實(shí)驗(yàn)。分為高氧組(HO組)和空氣對(duì)照組(Air組)

7、，前者按5L/min通入95％氧、5％二氧化碳高純混合氣，10 min后密封，與后者一起置于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞生長情況，收取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清作乳酸脫氫酶及8異前列腺素2α(8-iso-PGF2α)含量檢測(cè)。 結(jié)論： 1．成功地分離、純化及培養(yǎng)了原代早產(chǎn)AAZC Ⅱ。 2．成功建立了AEC Ⅱ高氧的細(xì)胞損傷模型。 第二章 HGF對(duì)高氧暴露早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖、凋亡與功能的影晌

8、 目的：探討高氧暴露及HGF對(duì)體外培養(yǎng)早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖、凋亡與功能的影響 方法：MTT比色法檢測(cè)不同濃度HGF對(duì)早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞生長的影響，確定實(shí)驗(yàn)用HGF最佳濃度。20d早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ，經(jīng)貼壁純化后隨機(jī)分為4組(每組五瓶)：空氣組(Air)、高氧組(HO)、空氣+HGF組(Air+HGF)、高氧+HGF組(HO+HGF)。HO、HO+HGF組在更換培養(yǎng)液后按5 L/min通入95％氧、5％二氧化碳高純混合氣

9、，10min后密封。Air+HGF、HO+HGF組在更換培養(yǎng)液時(shí)加入25ng/mlHGF(根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，各組均置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO<,2>)中培養(yǎng)24 h，收取各組細(xì)胞作流式細(xì)胞術(shù)法觀察AEC Ⅱ的增殖和凋亡情況，RT-PCR分析各組SPA、SPB、SPC mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1、HGF可促進(jìn)空氣暴露的早產(chǎn)NAEC Ⅱ細(xì)胞增殖，在一定范圍內(nèi)成劑量依賴性。 2、高氧可導(dǎo)致早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞增殖

10、抑制，凋亡增加。 3、高氧抑制早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞肺表面活性物質(zhì)蛋白的表達(dá)。 4、HGF可部分逆轉(zhuǎn)高氧對(duì)早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ損傷，促進(jìn)早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞增殖，凋亡減少；促進(jìn)AEC Ⅱ細(xì)胞肺表面活性物質(zhì)蛋白的表達(dá)，因而對(duì)高氧所致早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。 第三章 HGF對(duì)高氧暴露早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制 目的：在早產(chǎn)SD大鼠AEC Ⅱ高氧損傷模型上運(yùn)用RT-PCR、流式細(xì)胞檢測(cè)及We

11、stern blot等方法檢測(cè)PI-3K/Akt磷酸化阻斷劑LY294002運(yùn)用前后p-Akt、P21<'CIP1>、PCNA蛋白及Bcl-2、P21 <'CIP1>、PCNA基因的表達(dá)，以及細(xì)胞周期的變化，探討HGF對(duì)高氧損傷的AEC Ⅱ保護(hù)作用的分子機(jī)制及可能的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 方法：20d早產(chǎn)鼠AECⅡ，經(jīng)貼壁純化后隨機(jī)分為4組(每組10瓶)：空氣組(Air)、高氧組(HO)、空氣+HGF組(Air+HGF)、高氧+HGF組

12、(HO+HGF)，每組隨機(jī)抽取5瓶使用普通培養(yǎng)液，另5瓶使用含P13/Akt阻斷劑(LY294002)的培養(yǎng)液，HO、HO+HGF組按5 L/min通入95％氧和5％二氧化碳的高純混合氣，10 min后密封。Air+HGF、HO+HGF組在更換培養(yǎng)液時(shí)加入25ng/mlHGF，各組均置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO<,2>)中培養(yǎng)24 h，收取各組細(xì)胞作流式細(xì)胞、RT-PCR及Western blot檢測(cè)。 結(jié)果：①阻斷后HGF對(duì)高

13、氧所致早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞生長周期及凋亡的影響：與Air組比，HO組Sub G1、G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低，S期細(xì)胞比例無明顯差異，與阻斷前相似；Air+HGF組Sub G1、G0/G1、G2/M期、S期細(xì)胞比例無明顯差異；與HO組比，HO+HGF組Sub G1、G0/G1、G2/M期、S期細(xì)胞比例無明顯差異。②阻斷前后HGF及高氧對(duì)早產(chǎn)鼠AEC Ⅱ細(xì)胞P21<'CIP1>、PCNA、Bel-2蛋白及基因

14、水平表達(dá)的影響：阻斷前后HO及HO+HGF組PCNA蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著低于Air組，P21 P21<'CIP1>蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著高于Air組；阻斷前HO+HGF組PCNA蛋白及mRNA表達(dá)水平高于HO組，P21<'CIP1>蛋白及mRNA表達(dá)水平低于HO組；阻斷后HO+HGF的PCNA、P21<'CIP1>表達(dá)水平較HO組比較無顯著差異。阻斷前后HO、HO+HGF組Bcl-2mRNA表達(dá)水平均顯著低于Air組；阻斷