超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在社區(qū)人群中的流行及碳青霉烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機(jī)制.pdf

1、抗生素的大量使用在起到治療感染的同時(shí)，也間接地選擇出了耐藥的菌株，并引起廣泛播散。耐藥菌株的流行不但會(huì)影響用藥者的治療效果，而且還會(huì)造成嚴(yán)重的社會(huì)影響。一直以來，耐藥監(jiān)控的重點(diǎn)都是醫(yī)療機(jī)構(gòu)，而社區(qū)人群中耐藥菌的流行狀況則很少有人關(guān)注。事實(shí)上，社區(qū)人群是一個(gè)不容忽視的群體，其在耐藥基因和耐藥菌的存儲(chǔ)和播散環(huán)節(jié)上起著重要作用。大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)是人類和動(dòng)物腸道中的一種重要的需氧和兼性厭氧菌。通常情況

2、下，人群腸道E.coli的耐藥情況可以反映社區(qū)耐藥基因流行狀況。
　　 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)是革蘭陰性菌中最為常見的一種耐藥機(jī)制。為了了解ESBLs在社區(qū)人群中流行的狀況，本課題對(duì)社區(qū)人群腸道E.coli中ESBLs流行狀況及其播散機(jī)制進(jìn)行了研究。同時(shí)，對(duì)期間從一位住院患者糞便中分離到一株碳青霉烯類抗生素耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxyto

3、ca，K。oxytoca)，本課題也對(duì)該菌進(jìn)行了深入的研究，以闡明其耐藥形成的機(jī)制。本課題內(nèi)容共包括以下兩個(gè)部分：
　　 一、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在社區(qū)人群中的流行
　　 目的：研究社區(qū)人群腸道E.coli中ESBLs的流行狀況及播散機(jī)制。方法：從福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢中心2009年1月～5月收集健康體檢者糞便標(biāo)本，篩選ESBLs陽性的E.coli菌株，協(xié)同紙片法確認(rèn)產(chǎn)ESBL，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其藥敏情況；PCR擴(kuò)增各

4、型ESBL基因、上下游調(diào)控序列、整合子、系統(tǒng)分型基因、質(zhì)粒不相容性分型基因和E.coli ST131特異性基因。質(zhì)粒接合試驗(yàn)驗(yàn)證耐藥基因的轉(zhuǎn)移性；PFGE對(duì)ESBL陽性菌株進(jìn)行分型。結(jié)果：共從109例健康人糞便標(biāo)本中分離出55株(50.5％)產(chǎn)ESBLs的E.coli。菌株對(duì)三代頭孢類抗生素的敏感率差異很大，其中大約85％的菌株對(duì)頭孢他啶敏感，而對(duì)頭孢噻肟全部耐藥。PCR檢測(cè)共從31株細(xì)菌測(cè)出blaTEM，經(jīng)測(cè)序皆為blaTEM-1；另

5、外OXA-1陽性菌株有3例。所有菌株都檢出blaCTX-M，其中CTX-M-9組ESBLs菌株有41例，其中以blaCTX-M-14為主；CTX-M-1組ESBLs菌株檢出16例，大部分為blaCTX-M-15型。共有90.0％(50/55)的菌株攜帶的blaCTX-M上游檢出ISEcp1序列，而只在1株細(xì)菌blaCTX-M上游檢出IS26。E.coli檢出4株ST131克隆株。45株E.coli接合試驗(yàn)成功，其余10株經(jīng)電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，獲

6、得8株轉(zhuǎn)化子?？山雍闲再|(zhì)粒分型：82.2％(37/45)的接合性質(zhì)粒成功分型；共檢出7種不同類型的質(zhì)粒，其中IncFIB和Inc I1陽性率最高。經(jīng)電轉(zhuǎn)化獲得的8株轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒共有7株分型成功。其中IncFIA型質(zhì)粒4例，IncFIB型質(zhì)粒2例，和IncB/O型質(zhì)粒1例。E.coli系統(tǒng)分型以A和D型占多數(shù)；另外在B2型E.coli中檢出4株ST131克隆株。PFGE分型結(jié)果顯示ESBL陽性菌株為非克隆傳播，且首次發(fā)現(xiàn)E.coli

7、ST131克隆株定植于健康人腸道內(nèi)。結(jié)論：社區(qū)人群腸道E.coli中ESBLs基因具有攜帶率高、易轉(zhuǎn)移性和非克隆傳播三個(gè)特點(diǎn)。
　　 二、碳青霉烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機(jī)制
　　 目的：探討一株耐碳青霉烯類藥物K.oxytoca耐藥機(jī)制。方法：紙片擴(kuò)散法和E-test檢測(cè)待檢菌株及其接合子、重組子對(duì)13種抗生素的MIC值；PCR檢測(cè)各種耐藥基因；改良Hodge試驗(yàn)和組合紙片法檢測(cè)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶情況；質(zhì)粒接合試驗(yàn)驗(yàn)證耐

8、藥決定因子的可轉(zhuǎn)移性；隨機(jī)克隆法研究耐藥基因的基因環(huán)境；Southern blot對(duì)耐藥基因進(jìn)行定位提取外膜蛋白，分析其在耐碳青霉烯類抗生素中的作用。結(jié)果：該菌除了對(duì)環(huán)丙沙星的MIC=0.75μg/ml外，其余12種抗生素的MIC均>32μg/ml；改良Hodge試驗(yàn)提示菌株產(chǎn)碳青霉烯酶；組合紙片法顯示菌株可能產(chǎn)KPC和MBL兩種酶；PCR檢測(cè)出KPC-2和IMP-8兩種基因；克隆試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)blaKPC-2的基因環(huán)境大致為ISKpn8-t

9、runcated blaTEM-blaKPC-ISKpn6結(jié)構(gòu)，而blaIMP-8的基因環(huán)境大致為IS26-IntI1-blaIMP-8-aacA4-tniC結(jié)構(gòu)。Southern blot試驗(yàn)表明blaKPC-2定位于一個(gè)大小約為54kb的接合性質(zhì)粒上，而blaIMP-8定位于一個(gè)大小約180kb的接合性質(zhì)粒上。SDS-PAGE電泳顯示菌株存在膜孔蛋白的缺失。結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶KPC和IMP兩種類型碳青霉烯類耐藥基因的革蘭陰性菌，