產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌對(duì)磷霉素的耐藥機(jī)制研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacteriaceae）可引起多種社區(qū)及醫(yī)院獲得性感染，其中尿路感染(UTIs)是臨床常見(jiàn)感染性疾病，約有80％的非復(fù)雜性UTIs和40％的復(fù)雜性UTIs為大腸埃希菌等腸桿菌科細(xì)菌感染所致。近年來(lái)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）腸桿菌科細(xì)菌發(fā)生率不斷升高，造成臨床可選用的有效抗菌藥物減少。
　　磷霉素是一種廣譜殺菌劑，對(duì)臨床常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌和陰性

2、菌均具有抗菌活性，與其他抗菌藥無(wú)交叉耐藥性，而與多種抗菌藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)呈協(xié)同作用。磷霉素在國(guó)內(nèi)常與萬(wàn)古霉素聯(lián)合治療甲氧西林耐藥金葡菌(MRSA)等多重耐藥菌感染，不良反應(yīng)低。在國(guó)際上，磷霉素用于治療非復(fù)雜性下尿路感染已有40年余，近年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用磷霉素治療各類UTIs仍然高度有效，且細(xì)菌耐藥率低。2010年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(IDSA)和歐洲微生物學(xué)和感染病學(xué)會(huì)(ESCMID)推薦將磷霉素口服用于治療非復(fù)雜性UTIs，磷霉素靜脈制劑用于產(chǎn)E

3、SBLs腸桿菌科細(xì)菌感染。因?yàn)榇竽c埃希菌產(chǎn)ESBLs發(fā)生率高，選用藥物有限，國(guó)內(nèi)也將磷霉素作為復(fù)雜性尿路感染的治療藥物。
　　1999年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定磷霉素敏感性判定標(biāo)準(zhǔn):MIC≤64μg/ml敏感，MIC=128μg/ml中介，MIC≥256μg/ml耐藥，僅推薦用于尿道分離大腸埃希菌。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)非尿道分離大腸埃希

4、菌和其他腸桿菌科細(xì)菌的研究亦多應(yīng)用此標(biāo)準(zhǔn)。2009年12月歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting，EUCAST)推薦以MIC≤32μg/ml為磷霉素敏感性折點(diǎn)，適用于分離自所有部位的腸桿菌科細(xì)菌。
　　腸桿菌科細(xì)菌對(duì)磷霉素也存在耐藥現(xiàn)象，耐藥機(jī)制主要包括藥物攝取減少，靶酶位點(diǎn)改變和磷霉素修飾酶產(chǎn)生。
　　本課題根據(jù)CLSI

5、的ESBL確證試驗(yàn)結(jié)果，收集了復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2008年臨床分離的產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌257株，包括144株大腸埃希菌和113株肺炎克雷伯菌。測(cè)定細(xì)菌對(duì)磷霉素及其他抗菌藥物敏感性;通過(guò)PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，了解fos基因攜帶情況及周邊序列;對(duì)fos基因陰性的磷霉素耐藥菌株進(jìn)行磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及靶酶相關(guān)的耐藥機(jī)制研究。從而了解產(chǎn)ESBLs細(xì)菌對(duì)磷霉素的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制，明確fos耐藥基因的傳播機(jī)制，為多重耐藥菌的防控及抗菌治療提供

6、理論基礎(chǔ)。本研究包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌對(duì)磷霉素及其他抗菌藥物的敏感性
　　方法與結(jié)果:用瓊脂稀釋法測(cè)定磷霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、四環(huán)素、氯霉素18種抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌的最低抑菌濃度(MinimalInhibitorty Con

7、centration，MIC)。測(cè)定磷霉素MIC時(shí)瓊脂中加入葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-pho sphate，G-6-P），濃度為25μg/m。磷霉素敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用2013版EUCAST藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)(MIC≤32μg/ml為敏感折點(diǎn))。其他抗菌藥物根據(jù)2010年版CLSI藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。統(tǒng)計(jì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)各種抗菌藥物的敏感率，比較對(duì)除磷霉素外的非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物不敏感菌株和敏感菌株分別對(duì)磷霉素的敏感率。

8、
　　76.4％(110/144)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和77.9％(88/113)肺炎克雷伯菌對(duì)磷霉素敏感，兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.778)。如以MIC≤64μg/ml為磷霉素敏感性折點(diǎn)（CLSI尿路分離大腸埃希菌判定標(biāo)準(zhǔn)），產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)磷霉素敏感率分別為82.6％和84.1％。
　　產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松均耐藥，對(duì)哌拉西林敏感率≤5％，部分菌株對(duì)頭

9、孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南敏感，對(duì)亞胺培南、美羅培南敏感率＞96％，對(duì)頭孢西丁敏感率為59％～63％。大腸埃希菌對(duì)哌拉西林/他也唑巴坦敏感率為83.3％，肺炎克雷伯菌敏感率為46.9％。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)阿米卡星敏感率為88.9％，而對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、四環(huán)素、氯霉素敏感率均低于50％。肺炎克雷伯菌除對(duì)四環(huán)素敏感率為61.0％外，對(duì)其他藥物敏感率亦低于50％。
　　阿米卡星不敏感大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌

10、對(duì)磷霉素敏感率分別為31.2％(5/16)和71.6％(48/67)。除阿米卡星、美羅培南和亞胺培南不敏感株外，其他抗菌藥物不敏感菌株對(duì)磷霉素敏感率均＞68％。
　　98.6％(142/144)大腸埃希菌和86.7％(98/113)肺炎克雷伯菌檢出CTX-M型ESBLs基因，CTX-M基因分型與磷霉素耐藥率無(wú)明顯關(guān)系（CTX-M-1組與CTX-M-9組比較，P值分別為0.882，0.664）。23.0％(26/113)肺炎克雷伯菌

11、檢出SHV型ESBLs或SHV合并CTX-M型ESBLs。
　　小結(jié):磷霉素對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌具有良好抗菌活性，其他抗菌藥物耐藥株對(duì)磷霉素也有較高敏感性。
　　第二部分 fos基因相關(guān)的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥機(jī)制
　　背景:產(chǎn)生修飾酶是細(xì)菌對(duì)磷霉素的主要耐藥機(jī)制之一，通過(guò)對(duì)磷霉素分子結(jié)構(gòu)的修飾使磷霉素失活，目前發(fā)現(xiàn)的磷霉素修飾酶主要有FosA、FosB、FosC、FosX及其各亞型。在磷霉素耐藥腸

12、桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了fosA、fosA2、fosA3、fosC2基因。osA基因定位于質(zhì)粒，最初發(fā)現(xiàn)于粘質(zhì)沙雷菌中，后相繼在多種腸桿菌科、假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)。希臘一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)10％(3/30)磷霉素耐藥腸桿菌科細(xì)菌攜帶osA基因。2009年Wachino等學(xué)者在日本產(chǎn)CTX-M的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)兩種新型質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因fosA3和fosC2。多項(xiàng)研究顯示1.0％-9.0％大腸埃希菌和1.1％肺炎克雷伯菌攜fosA3基

13、因。研究發(fā)現(xiàn)fosA3常與blaCTX-M(、)rmtB基因共同轉(zhuǎn)移。攜fosA3基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移很可能會(huì)加速磷霉素耐藥性播散，同時(shí)因其與ESBLs及其他耐藥基因之間的密切關(guān)系可能造成不同類別抗菌藥物耐藥性共同傳播。本部分研究通過(guò)PCR擴(kuò)增，了解產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌特別是磷霉素耐藥菌株中fos基因攜帶情況;通fos基因周邊DNA序列測(cè)定，了解其周邊結(jié)構(gòu)。
　　方法與結(jié)果:257株產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌中行PCR檢測(cè)fosA，fo

14、sA2，fosA3，fosC2基因。對(duì)磷霉素不敏感菌株同時(shí)進(jìn)fosB，fosB2，fosC，fosX基因檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13.2％(19/144)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和3.5％(4/113)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌攜fosA3基因。fosA3基因陽(yáng)性菌株均對(duì)磷霉素高度耐藥。fosA3基因在磷霉素耐藥菌中的檢出率分別為55.9％(19/34)和16％(4/25)，在高度耐藥菌株（MIC≥256μg/ml）中的檢出率分別為76.0％(19

15、/25)和28.6％(4/14)。有1株肺炎克雷伯菌K117檢出fosA基因，其磷霉素MIC為32μg/ml。未檢測(cè)到fosA2、fosC2、fosB、fosB2、fosC、fosX陽(yáng)性菌株。
　　23株菌株中fosA3基因全長(zhǎng)序列與最初報(bào)道的fosA3核苷酸同源性均為100％。1株肺炎克雷伯菌fosA基因(fosAK117)與在Tn2921中發(fā)現(xiàn)的fosA(fosATn2921)有95％同源性，氨基酸序列FosAK117與Fos

16、ATn292197.9％同源。對(duì)其中1株大腸埃希菌fosA3和肺炎克雷伯菌的fosA進(jìn)行TA克隆，fos A3和fosA基因克隆株均對(duì)磷霉素高度耐藥(MIC分別為1024μg/ml及≥1024μg/ml)。
　　以大腸埃希菌C600或J53為受體菌，對(duì)所有磷霉素耐藥菌株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)，并對(duì)接合子PCR檢測(cè)ESBLs基因、fos基因，ERIC PCR確證為接合子。23fosA3陽(yáng)性菌中20株fosA3攜帶菌株成功接合，其中16

17、株細(xì)菌fosA3基因與CTX-M型ESBLs基因共同轉(zhuǎn)移，12株細(xì)菌中osA3與TEM-1廣譜β內(nèi)酰胺酶基因共同轉(zhuǎn)移。fosA基因陽(yáng)性肺炎克雷伯菌K117未能接合成功。
　　對(duì)5株fosA3接合子行引物步移法DNA測(cè)定分析fosA3基因周邊序列。5株細(xì)菌質(zhì)粒fosA3上游均為插入序列IS26,與fosA35'端之間長(zhǎng)度均為322bp。fosA3下游不完全相同:3株細(xì)菌質(zhì)粒fosA3下游為IS26，與fosA33'端之間長(zhǎng)度為536

18、bp或1758bp;2株細(xì)菌質(zhì)粒fosA3下游為IS1294。對(duì)其中3株細(xì)菌行長(zhǎng)序列測(cè)序、分析fosA3與ESBLs基因的位置關(guān)系，3株細(xì)菌質(zhì)粒中blaCTX-M位于fosA3上游，其中2株細(xì)菌質(zhì)粒同時(shí)攜帶4個(gè)耐藥基因:fosA3，blaCTX-M-9，blaTEM-1，rmtB。
　　1株磷霉素耐藥但os基因PCR檢測(cè)陰性的大腸埃希菌E265，磷霉素的耐藥性可通過(guò)接合試驗(yàn)轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌J53。提取接合子質(zhì)粒進(jìn)行酶切克隆、DNA

19、序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的fosA基因亞型(暫命名為fosA4)，介導(dǎo)大腸埃希菌E265對(duì)磷霉素的耐藥性。osA4與fosATn2921、fosA2、fosA3核苷酸序列有69％～73％的同源性。FosA4氨基酸序列與FosATn2921、FosA2、FosA3同源性為69％～80％，與FosB、FosC、FosX的同源性為14％～31％。
　　對(duì)fosA3基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行MLST分型，發(fā)現(xiàn)菌株間的同源性低，19株fosA3陽(yáng)性大腸埃

20、希菌屬于11個(gè)ST型，4株fosA3陽(yáng)性肺炎克雷伯菌屬于3個(gè)ST型。
　　小結(jié):fosA3為產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌中最為流行的fos基因類型，并為本研究中大腸埃希菌對(duì)磷霉素高度耐藥的主要機(jī)制。fosA3基因常與ESBLs基因共同轉(zhuǎn)移。在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了新的質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因亞型fosA4。IS26可能與fosA3轉(zhuǎn)移和傳播有關(guān)。
　　第三部分轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及靶酶相關(guān)的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)磷霉素的耐藥機(jī)制
　　背景:磷霉素靶

21、酶為二磷酸尿嘧啶-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(MurA)，磷霉素通過(guò)使其失活，干擾細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成，從而發(fā)揮殺菌作用。MurA突變或超表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。
　　磷霉素通過(guò)甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(GlpT)或磷酸己糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(UhpT)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。前者主要轉(zhuǎn)運(yùn)甘油-3-磷酸(G-3-P);后者轉(zhuǎn)運(yùn)G-6-P，并需G-6-P誘導(dǎo)打開(kāi)。GlpT功能正常的菌株可在以G-3-P為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基（G-3-P-M9）上生長(zhǎng)，GlpT功能障

22、礙的細(xì)菌則無(wú)法生長(zhǎng)。同理，UhpT功能正常的細(xì)菌可在G-6-P為唯一碳源的基本培養(yǎng)基(G-6-P-M9)上生長(zhǎng)，UhpT功能障礙者無(wú)法生長(zhǎng)。編碼基因glpT和uhpT基因突變可直接導(dǎo)致相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙，進(jìn)入細(xì)菌的磷霉素水平降低，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素敏感性降低。uhpA編碼一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)控UhpT表達(dá)。pts基因和cyaA基因突變可導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP水平下降。低水平的cAMP可以下調(diào)GlpT和UhpT表達(dá)，介導(dǎo)耐藥。
　　方

23、法與結(jié)果:對(duì)15株fos基因陰性的磷霉素高度耐藥菌（包括大腸埃希菌5株，肺炎克雷伯菌10株）進(jìn)行靶酶murA基因PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定。5株大腸埃希菌靶酶MurA氨基酸序列均無(wú)突變。1株肺炎克雷伯菌K672的MurA存在Gln7Pro氨基酸突變。4株肺炎克雷伯菌K2103，K2610，K190，K2304的murA基因擴(kuò)增不成功，其他5株肺炎克雷伯菌靶酶MurA氨基酸序列無(wú)突變。
　　將15株fos基因陰性的磷霉素高度耐藥菌及標(biāo)準(zhǔn)菌

24、株ATCC25922接種到以甘油-3-磷酸(Glycerol3-phosphate, G-3-P)或G-6-P為單一碳源的M9基本培養(yǎng)基上。5株磷霉素耐藥大腸埃希菌和1株肺炎克雷伯菌無(wú)法在G-3-P-M9和G-6-P-M9上生長(zhǎng)，提示這6株細(xì)菌同時(shí)存在兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)(GlpT和UhpT)功能障礙。9株fos基因陰性磷霉素耐藥肺炎克雷伯菌可在G-6-P-M9上生長(zhǎng)，但在G-3-P-M9上未生長(zhǎng)，提示這9株細(xì)菌UhpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能正常，而G

25、lpT系統(tǒng)存在功能障礙。
　　對(duì)15株耐藥菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因glpT、 uhpT、 uhpA、pstI、 cyaA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定。5株磷霉素耐藥大腸埃希菌glpT基因全序列均擴(kuò)增失敗，內(nèi)部保守序列引物擴(kuò)增成功，推測(cè)這5株大腸埃希菌glpT邊緣序列可能存在大段缺失或突變。10株磷霉素耐藥肺炎克雷伯菌glpT基因全序列及保守序列均擴(kuò)增失敗，推測(cè)10株肺炎克雷伯菌中g(shù)lpT基因整個(gè)缺失或突變。glpT整個(gè)基因序列或大段

26、序列的缺失或突變可能直接導(dǎo)致GlpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能障礙。
　　無(wú)法在G-6-P-M9上生長(zhǎng)的6株細(xì)菌（5株大腸埃希菌和1株肺炎克雷伯菌）UhpT氨基酸序列均無(wú)突變，提示UhpT功能障礙可能與UhpT轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平有關(guān)。其余9株細(xì)菌可在G-6-P-M9上生長(zhǎng)，其中4株細(xì)菌UhpT序列無(wú)突變，3株細(xì)菌UhpT序列存在Ile127Val氨基酸突變，2株肺炎克雷伯菌UhpT全序列未能成功擴(kuò)增。
　　除2株大腸埃希菌E2393和E296

27、7的UhpA序列測(cè)序失敗，1株肺炎克雷伯菌K672的UhpA全序列擴(kuò)增失敗外，其他菌株UhpA氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)突變。5株大腸埃希菌中PstI和CyaA序列存在較多氨基酸位點(diǎn)突變。肺炎克雷伯菌中PstI和CyaA序列多擴(kuò)增失敗或多次擴(kuò)增濃度較低、測(cè)序失敗，僅2株肺炎克雷伯菌細(xì)菌PstI序列擴(kuò)增成功，存在Va1229Ile，Asn241Ser突變。UhpA、PstI和CyaA是否可通過(guò)影響GlpT或UhpT表達(dá)介導(dǎo)耐藥尚需進(jìn)一步研究。