大鼠觸液核降鈣素基因相關(guān)肽的分布及其在內(nèi)臟痛中的作用.pdf

1、目的：1.觀察正常大鼠觸液核(cerebrospinal fluid-contacting nucleus，CSF-CN)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的分布。
　　2.內(nèi)臟痛大鼠觸液核CGRP的變化。
　　3.通過外源性的CGRP和CGRP受體拮抗劑CGRP8-37注入大鼠觸液核進一步探究CGRP對內(nèi)臟痛調(diào)控中的作用。
　　方法：實驗用Sprague-Da

2、wley大鼠，分組如下：
　　1.SD大鼠，正常組(n=8)，大鼠處死前48h側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B，CB)逆行追蹤定位CSF-CN，采用免疫熒光雙標確定在觸液核有無CGRP的分布；
　　2.內(nèi)臟痛模型分兩組：直結(jié)腸擴張組(noxious phasic colorectal distension，CRD)，傷害性直結(jié)腸擴張(80mmHg)模擬內(nèi)臟高敏性(visceral hypersens

3、itivity，VH)模型和對照組：非傷害性直結(jié)腸擴張(20mmHg)。通過行為學(xué)和肌電分析分別觀察了腹壁回撤反射評分(abdominal withdrawal reflex，AWR)和腹壁外斜肌放電幅度(electromyographic activity，EMG)。采用側(cè)腦室注射霍亂毒素B亞單位(choleratoxin B)追蹤定位CSF-CN，免疫熒光雙標探索對照組大鼠CSF-CN和模型大鼠CSF-CN中CGRP在不同時間的分布

4、變化；蛋白質(zhì)免疫印記定量標記CGRP含量的變化趨勢；大鼠痛閾和腹肌放電幅度變化與觸液核中CGRP變化趨勢的相關(guān)性；
　　3.探討了外源性的CGRP和CGRP受體拮抗劑，CGRP8-37注入SD大鼠的CSF-CN上，對大鼠內(nèi)臟痛行為學(xué)的變化，腹壁外斜肌放電幅度變化的影響。采用Image-Pro Plus6.0圖像軟件對CGRP陽性神經(jīng)元進行計數(shù)和采用Photoshop5.0對免疫印記條帶進行分析。
　　結(jié)果：1.正常大鼠CB免

5、疫陽性物質(zhì)的分布
　　CB免疫陽性物質(zhì)規(guī)律而集中地分布在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹側(cè)部，而CGRP免疫陽性物質(zhì)散在分布，部分CB免疫陽性神經(jīng)細胞胞質(zhì)中共表達CGRP免疫陽性物質(zhì)，一些非CB陽性神經(jīng)細胞的胞質(zhì)中也存在CGRP陽性物質(zhì)。
　　2.內(nèi)臟痛模型的行為學(xué)和實驗室結(jié)果
　　CRD組大鼠痛閾和對照組大鼠痛閾比較顯示，CRD組大鼠痛閾有降低的趨勢，模型第3天，CRD組大鼠的疼痛閾值較對照組大鼠降低明顯，對照組大鼠痛閾(34.

6、0±1.3)mmHg，CRD組大鼠是(31.3±2.3)mmHg(F=77，P<0.05)。模型組腹外斜肌放電幅度和對照組相比較，有明顯增高趨勢，在第3天(F=13.66，P<0.05)。模型組大鼠和對照組大鼠的觸液核相比較，規(guī)律而集中分布于PAG的腹側(cè)的CB免疫陽性CSF-CN細胞數(shù)沒有變化，但CSF-CN的CGRP免疫陽性物質(zhì)表達的神經(jīng)細胞數(shù)逐漸增加。內(nèi)臟痛后第5天CGRP陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，模型組(476±5)，對照組(290

7、±5)，和對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(F=953.66，P<0.01)。免疫蛋白印記顯示造模后觸液核中CGRP的含量也存在遞增趨勢(P<0.05)。CRD組大鼠痛閾變化和觸液核中CGRP含量改變成負相關(guān)(P<0.01)，而腹壁肌放電幅度和觸液核中CGRP成正相關(guān)(P<0.01)。
　　3.外源性藥物對行為學(xué)的影響
　　內(nèi)臟痛模型下，外源性的CGRP注入CSF-CN后，疼痛行為學(xué)的變化有劑量依賴性，0.13nmol和0.26nmo

8、l的CGRP，可導(dǎo)致AWR評分明顯降低(P<0.05)和腹外斜肌EMG放電幅度也減少(P<0.05)，0.026nmol的CGRP對AWR和腹外斜肌放電幅度沒有明顯影響(P>0.05)。隨著CGRP劑量的增加，AWR評分和EMG放電幅度減少越顯著(P<0.05)。CGRP受體拮抗劑，CGRP8-37能逆轉(zhuǎn)CGRP引起的行為學(xué)的變化(P<0.05)。CGRP8-37的劑量越大，拮抗效果越顯著。
　　結(jié)論：1.正常大鼠CSF-CN有C