利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)剖析玉米遺傳重組交換和單倍體誘導(dǎo)的機(jī)制.pdf

1、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的一種新技術(shù)，雖然廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物遺傳學(xué)，胚胎學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的研究和疾病的診斷與治療，但是植物單細(xì)胞測(cè)序研究仍然困難重重。本研究以玉米的花粉為模式材料，探索植物單細(xì)胞的分離和測(cè)序技術(shù)，建立相應(yīng)的分析平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，通過兩個(gè)實(shí)例研究探討單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用:1）通過對(duì)玉米四分體的四個(gè)小孢子的測(cè)序分析，首次在單細(xì)胞水平探討了植物重組的遺傳基礎(chǔ);2）通過對(duì)不同時(shí)期玉米單倍體誘導(dǎo)系的花粉進(jìn)行測(cè)序分

2、析，探討了玉米單倍體誘導(dǎo)(HI)發(fā)生的機(jī)制和規(guī)律。主要結(jié)果如下:
　　1.發(fā)展一種分離植物單個(gè)四分體孢子的方法，用于基因組多重置換擴(kuò)增(MDA)。對(duì)來自24個(gè)F1四分體的96個(gè)小孢子的擴(kuò)增DNA樣品進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，平均深度為1.4X，平均基因組覆蓋度為41％。通過測(cè)序，共獲得599，154高密度的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）標(biāo)記，其相鄰SNP物理間距的中位數(shù)為235bp。通過比較小

3、孢子基因組的遺傳背景，共鑒定到924個(gè)被精細(xì)定位的同源重組交換(CO)，發(fā)現(xiàn)玉米一次減數(shù)分裂平均發(fā)生38.5個(gè)CO。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CO更傾向于發(fā)生在靠近基因的區(qū)域，而且常常富集于基因的5'和3'末端。通過對(duì)5個(gè)CO區(qū)段進(jìn)行Sanger測(cè)序，在每個(gè)區(qū)段中都發(fā)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)換(GC)，表明CO的產(chǎn)生常伴隨著GC的發(fā)生。首次在小孢子中檢測(cè)到了較強(qiáng)的交換負(fù)干涉和較弱的染色單體干涉。本研究在增強(qiáng)對(duì)減數(shù)分裂重組發(fā)生機(jī)制理解的同時(shí)，也為進(jìn)一步提高育種效率

4、提供了新思路。
　　2.發(fā)展一種分離誘導(dǎo)系CAU5成熟花粉單核的方法。利用該方法，分離到來自22個(gè)CAU5花粉的66個(gè)單核。同時(shí)分離到來自18個(gè)CAU5四分體的72個(gè)小孢子。將CAU5的單核及單細(xì)胞樣品進(jìn)行基于PCR的全基因組擴(kuò)增(WGA)后，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序和拷貝數(shù)變異(CNV)分析。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)系CAU5在三核花粉期存在高頻的染色體非整倍性變異（6/22個(gè)花粉），而在四分體時(shí)期只存在很低頻的倍性異常（1/72個(gè)小孢子），這說明誘

5、導(dǎo)系的花粉在減數(shù)分裂期之后會(huì)產(chǎn)生染色體的片段化現(xiàn)象。
　　3.發(fā)展一種分離常規(guī)自交系單精子的方法。利用該方法，分離到來自普通自交系B73的25個(gè)花粉的50個(gè)單精子和來自B73背景的誘導(dǎo)系（B73-inducer，80％的B73背景和20％的CAU2誘導(dǎo)系背景）的26個(gè)花粉的52個(gè)單精子，然后進(jìn)行基于PCR的全基因組擴(kuò)增，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序和CNV分析。在B73-inducer的單精核中發(fā)現(xiàn)高頻的染色體非整倍性（14/52精核）變異

6、，頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自交系B73（3/50精核），說明單倍體誘導(dǎo)的發(fā)生可能和花粉精核的非整倍性變異相關(guān)。
　　4.為了進(jìn)一步證明花粉染色體片段化與單倍體胚誘導(dǎo)之間的關(guān)系，對(duì)來自與誘導(dǎo)系雜交授粉后9天的88個(gè)籽粒中的81個(gè)胚和81個(gè)胚乳DNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析。在7個(gè)胚中發(fā)現(xiàn)了父源基因組的全部消除。在1個(gè)胚中發(fā)現(xiàn)了大部分父源基因組的消除，但仍有少部分殘余。在3個(gè)樣品中檢測(cè)到小片段的CNV?；谝陨蠑?shù)據(jù)，得出結(jié)論:染色體的片段化是單倍體誘導(dǎo)