腫瘤候選基因PRR11原核、真核表達(dá)載體構(gòu)建、細(xì)胞定位及功能的初步研究.pdf

1、PRR11是一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，共編碼360個(gè)氨基酸，基因位于染色體17q22，此區(qū)域是在肺癌等各種腫瘤上的一個(gè)高發(fā)的基因擴(kuò)增區(qū)，通過前期的研究表明，此基因可能是一種新的腫瘤相關(guān)基因，對(duì)新的腫瘤相關(guān)基因的研究不僅有助于進(jìn)一步闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，而且也可能作為有效的生物靶點(diǎn)用于尋找新的腫瘤診斷方法以及開發(fā)新的抗腫瘤藥物。本課題通過構(gòu)建PRR11真核、原核表達(dá)載體，通過過表達(dá)觀察對(duì)細(xì)胞周期的影響，并觀察蛋白細(xì)胞定位，對(duì)深入研究PRR

2、11功能奠定基礎(chǔ)。 第一部分PRR11基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定 目的：構(gòu)建人PRR11基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)及鑒定。 方法：以Hela細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PRR11基因，克隆入原核表達(dá)載體PET-28a中，測序正確后，再把構(gòu)建好的重組原核表達(dá)載體PET-28a-PRR11轉(zhuǎn)化到BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，提取細(xì)胞蛋白并用Western blot分析目的蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：

3、成功擴(kuò)增了PRR11基因，雙酶切鑒定證實(shí)目的基因成功克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中，測序結(jié)果序列完全正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化到BL21細(xì)胞中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白成功表達(dá)，Western blot分析也證實(shí)了目的蛋白表達(dá)成功。 結(jié)論：成功構(gòu)建了PRR11基因的原核表達(dá)載體，為深入研究PRR11基因功能奠定基礎(chǔ)。 第二部分PRR11基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定。 目的：構(gòu)建人PRR11基因真核表達(dá)載體

4、，檢測其表達(dá)情況。 方法：以PET-28a-PRR11為模板，通過PCR擴(kuò)增PRR11并將之克隆至pcDNA3.1真核表達(dá)載體，測序鑒定正確，PCR、Western blot鑒定。 結(jié)果：雙酶切鑒定證實(shí)目的基因成功克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，測序結(jié)果序列完全正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功，Western Blot檢測表明有目的蛋白表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建人PRR11基因的真核表達(dá)載體，并表達(dá)成功。第三部分PRR11細(xì)胞定位

5、及初步功能研究目的：構(gòu)建含GFP-PRR11的真核表達(dá)載體，觀察基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位以及對(duì)細(xì)胞周期的影響。方法：以PET-28a-PRR11為模板，通過PCR擴(kuò)增PRR11并將之克隆至PEGFP-C1真核表達(dá)載體，測序鑒定正確，PCR、Westernblot鑒定。 結(jié)果：雙酶切鑒定證實(shí)目的基因成功克隆到真核表達(dá)載體PEGFP-C1中，測序結(jié)果序列完全正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功，Western Blot檢測表明有目的蛋白表達(dá)。