馬鈴薯低溫糖化相關(guān)淀粉酶基因的功能鑒定及機(jī)制解析.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的非谷物糧食作物，在保證人類糧食安全方面具有重要作用。薯片和薯?xiàng)l加工產(chǎn)品在加工業(yè)中占據(jù)著主要地位，為保證原材料的持續(xù)供應(yīng)，馬鈴薯塊莖經(jīng)常貯藏于低溫條件下（不高于10℃），然而低溫貯藏會(huì)導(dǎo)致還原糖積累，即為低溫糖化現(xiàn)象，使其在油炸加工過程中產(chǎn)生褐化反應(yīng)，影響產(chǎn)品品質(zhì)。前人研究表明淀粉降解是低溫糖化的主要路徑之一，但是并未鑒定到對(duì)低溫糖化起特異作用的淀粉降解酶基因，淀粉降解途徑的

2、低溫糖化機(jī)理尚不清楚。因此，本研究從全基因組角度對(duì)馬鈴薯α-淀粉酶和β-淀粉酶家族成員進(jìn)行了鑒定、功能驗(yàn)證及作用機(jī)制解析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定到2個(gè)α-淀粉酶、7個(gè)β-淀粉酶家族成員，它們不對(duì)稱地分布在馬鈴薯染色體上。通過不同物種的α-淀粉酶和β-淀粉酶系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)淀粉酶進(jìn)化比較保守，α-淀粉酶被聚為3個(gè)亞家族，β-淀粉酶被聚為4個(gè)亞家族。馬鈴薯β-淀粉酶基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析表明，聚

3、在相同亞家族的成員有相似的基因結(jié)構(gòu)，但葡糖基水解酶結(jié)構(gòu)域的比對(duì)結(jié)果顯示，其中一個(gè)β-淀粉酶家族成員StBAM9可能不具活性。
　　2.利用具有不同低溫糖化抗性的馬鈴薯基因型，在不同植物組織及不同貯藏溫度下的塊莖中進(jìn)行淀粉酶家族成員的表達(dá)分析，篩選到3個(gè)受低溫響應(yīng)并且在塊莖中誘導(dǎo)表達(dá)的淀粉酶，分別是α-淀粉酶StAmy23、β-淀粉酶StBAM1和StBAM9。
　　3.為了明確StAmy23、StBAM1和StBAM9在細(xì)胞

4、中的作用部位，分別構(gòu)建了這三個(gè)基因融合綠色熒光蛋白的表達(dá)載體StAmy23-GFP、StBAM1-GFP、StBAM9-GFP和淀粉粒標(biāo)記基因融合紅色熒光蛋白的表達(dá)載體StGBSS-RFP，通過兩種方法（基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)方法），將目標(biāo)基因與標(biāo)記基因進(jìn)行共表達(dá)，并與細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記基因RFP和葉綠素自發(fā)熒光疊加分析，首次證明StAmy23定位于細(xì)胞質(zhì)，StBAM1定位于質(zhì)體基質(zhì)，StBAM9定位于淀粉粒。此外，又對(duì)StBAM1

5、、StBAM9和StGBSS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和截去轉(zhuǎn)運(yùn)肽的StBAM1、StBAM9和StGBSS進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，它們的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位于淀粉粒，但是StBAM1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽不穩(wěn)定，可能后期轉(zhuǎn)移至基質(zhì)，與其全長(zhǎng)定位于質(zhì)體基質(zhì)相關(guān)。這些結(jié)果說明StBAM1和StBAM9的定位取決于自身的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
　　4.為了研究StAmy23、StBAM1和StBAM9在馬鈴薯塊莖低溫糖化中的功能，分別構(gòu)建了StBAM1和StBAM

6、9基因的RNA干涉表達(dá)載體及StBAM1和StBAM9雙干涉表達(dá)載體，分別遺傳轉(zhuǎn)化不抗低溫糖化的馬鈴薯品種鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)，RNAi-StAmy23轉(zhuǎn)基因株系由前人獲得。分別測(cè)定了轉(zhuǎn)基因株系的葉片淀粉含量及低溫貯藏塊莖中的糖含量、薯片油炸色澤、淀粉酶活性、淀粉含量等，結(jié)果表明，StBAM1和StBAM9參與了白天的葉片淀粉降解，但是在夜晚只有StBAM9與淀粉降解有關(guān)，而StAmy23在葉片淀粉降解過程中無顯著功能。在低溫貯藏的塊莖

7、中，與對(duì)照相比，干涉StBAM1的轉(zhuǎn)基因塊莖和同時(shí)干涉StBAM1和StBAM9的轉(zhuǎn)基因塊莖中β-淀粉酶活性降低，但是干涉StBAM9的轉(zhuǎn)基因塊莖中β-淀粉酶活性沒有顯著變化。干涉StBAM1和StBAM9均可抑制淀粉降解和還原糖積累，有效改善油炸加工品質(zhì)，而雙干涉轉(zhuǎn)基因的效果則更明顯，說明StBAM1和StBAM9可能存在功能疊加。另外，可溶性淀粉含量在干涉StBAM1的轉(zhuǎn)基因塊莖中增加，但是在干涉StBAM9的轉(zhuǎn)基因塊莖中顯著降低，

8、表明StBAM1可能通過水解質(zhì)體基質(zhì)中的可溶性淀粉來調(diào)節(jié)低溫糖化，而StBAM9可能直接作用于淀粉粒來調(diào)節(jié)低溫糖化。此外，干涉StAmy23導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因低溫貯藏塊莖中可溶性糖原含量顯著增加，還原糖含量降低，可能是StAmy23通過降解細(xì)胞質(zhì)中的可溶性糖原來參與低溫糖化的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步分析不同轉(zhuǎn)基因塊莖中還原糖的含量表明，StBAM9在低溫糖化中的功能最顯著，這3個(gè)淀粉酶分別在不同的亞細(xì)胞位置水解不同的底物，在馬鈴薯低溫糖化過程中發(fā)揮著不同水

9、平的功能，首次揭示了淀粉水解路徑在低溫糖化中的貢獻(xiàn)。
　　5.利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析了StAmy23、StBAM1、StBAM9分別與淀粉代謝相關(guān)蛋白磷酸酶(StLSF1和StLSF2)、葡聚糖水雙激酶(StGWD)和淀粉顆粒合酶(StGBSS)的互作關(guān)系，結(jié)果表明只有StLSF2與StBAM9互作，推測(cè)StLSF2可能參與到StBAM9介導(dǎo)的淀粉降解過程中。但原核表達(dá)蛋白StBAM1、StBAM9和StLSF2體外活性分析實(shí)驗(yàn)證

10、明，StLSF2不影響StBAM1、StBAM9的活性，StBAM1、StBAM9也不影響StLSF2的去磷酸化作用，推測(cè)StLSF2可能不是參與StBAM9水解路徑的一個(gè)重要因子。
　　6.利用馬鈴薯抗低溫糖化材料10908-06、CW2-1和低溫糖化敏感材料E3的塊莖，經(jīng)4℃貯藏5天后構(gòu)建了酵母雜交文庫。以StBAM9和截去葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的StBAM9-P分別作為餌蛋白，進(jìn)行酵母文庫篩選，總共篩選到63個(gè)潛在互作蛋白，其中一個(gè)潛