豬源腸外致病性大腸桿菌六型分泌系統(tǒng)PPECC33_00229基因缺失株的構建及功能研究.pdf

1、自Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)2006年被發(fā)現(xiàn)以來，這十年間它一直作為國內外學者的一個研究熱點，而關于腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)的T6SS的研究卻并不多。T6SS是一種在效應細胞與靶細胞之間轉運蛋白的動態(tài)裝置，它保守地存在于25％的革蘭氏陰性菌中，其中包括銅綠假單胞菌、霍亂弧菌及大腸桿菌等。T6SS還可分泌效應分子靶向競爭細菌及真核細胞，因此其在細菌的致病性中起重要作用。PCN033屬豬源腸外致病性大腸桿菌，它分離于2006年高熱病病

2、豬腦部，是一株高致病性菌株。通過對其全基因組測序及進一步的序列比對，發(fā)現(xiàn)了T6SS基因簇的存在。本研究中以PCN033作為研究對象，探究其T6SS簇內基因PPECC33_00229（以下簡稱0229）的功能。即構建以PCN033為親本菌株的△0229基因缺失株，通過比較其與親本菌株的生物學特性，探究基因0229的功能。
　　1.△0229基因缺失株及△0229-0229互補菌株的構建
　　采用的是自殺性質粒pRE112介導的

3、同源重組的方法，首先擴增0229的上下游同源臂。分別將擴增產物連接到穿梭質粒pBluescriptⅡ SK(+)上，酶切回收連接好的同源臂，轉而連接至pRE112上構建重組質粒。成功構建的重組質粒轉入x7213中，并以其為供體菌，PCN033為受體菌，進行接合轉移。經過兩次單交換過程，利用蔗糖敏感性及氯霉素抗性，對菌株進行正反篩選，進而得到△0229基因缺失株。通過所設計的基因外部及內部的鑒定引物，PCR擴增鑒定，最終確定△0229基因

4、缺失株的構建成功。
　　擴增0229基因產物，酶切擴增產物，并將其連入穿梭質粒pHSG396，成功構建的重組質粒電轉到△0229缺失株，氯霉素抗性平板篩選陽性克隆子，并通過設計的通用引物進行PCR驗證，成功獲得△0229-0229互補菌株。
　　2.細菌間競爭能力相關性的研究
　　以大腸桿菌的K12菌株W3110作為被捕食菌，野生株PCN033，缺失株△0229作為捕食菌株，進行種內競爭作用，結果顯示，與缺失株△022

5、9互作的試驗組中，W3110的存活率有明顯下降，也就是在基因0229缺失后，菌株的競爭能力增強。表明基因0229可能在細菌間的競爭中起到一定作用。
　　3.致病力相關性的研究
　　小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)作為細胞模型，進行的吞噬后存活試驗，分別比較野生株PCN033及缺失株△0229被細胞吞噬后，在各時間點的存活率，缺失株在2h、4h后相比野生株的存活能力雖有上升，但差異并不具有顯著性，而6h后的結果差異明顯。而

6、在以人腦微血管內皮細胞(HBMEC)為細胞模型的粘附侵入試驗中，相比于野生株PCN033，缺失株△0229試驗組的粘附侵入能力顯著上升，且互補菌株△0229-0229對這種表型的差異有明顯的回補效果，結果表明0229可能與PCN033粘附侵入HBMEC，引起腦膜炎相關。
　　以4周齡的雌性昆明鼠作為動物模型，比較野生株PCN033與缺失株△0229的組織定殖能力。摘取小鼠的腦、脾、肺及腎組織，并對其中的細菌量進行計數(shù)，缺失株△02

7、29試驗組在各組織中的菌量顯著高于野生株PCN033試驗組，表明缺失株△0229具有更強的組織定殖能力。利用菌株PCN033的本體動物豬的全血，進行全血殺菌試驗，比較野生株及缺失株在與全血互作1h、2h、3h后的存活率，結果顯示，相對于野生株，缺失株在各個時間點的存活率更高，但經過對數(shù)據(jù)的分析，該差異不具有顯著性。
　　4.熒光定量PCR對T6SS相關基因轉錄水平的檢測
　　熒光定量PCR檢測野生株PCN033及缺失株△02