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文檔簡介
1、腸致病性大腸桿菌是能引起動物體內(nèi)出血性和非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥的主要病原菌。最常見的菌株是o45,而o45的一個重要毒力特征是引起腸黏膜粘附和脫落損傷(A/E),EPEC的主要毒力因子定位于致病島(PathogenicityIsland,PAIs)和腸細胞脫落位點(The Locusofenterocyte effacement,LEE)上,其DNA長度為43kp,分LEEl,LEE2,LEE3,和LEE4四個基因區(qū),
2、LEEl包含ler(中心調(diào)節(jié)基因,LEE-encodedregulator),ler對LEE毒力基因群(LEE2、LEE3和LEE4)的表達起正調(diào)控作用,因此認為ler是EPEC毒力因子表達重要的中心調(diào)節(jié)基因。 在本研究中,構(gòu)建了045的ler基因缺失突變菌株并對其特性進行了研究:首先用PCR的方法擴增出缺失279bpler的基因片段,將其克隆到自殺性載體pCVD442中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCVD442::△ler,轉(zhuǎn)化到宿主菌S
3、M10pir,然后通過接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將自殺質(zhì)粒pCVD442::△ler從SM10pir轉(zhuǎn)到0157:H7中,轉(zhuǎn)導(dǎo)子過夜培養(yǎng)后鋪平板,通過蔗糖篩選氨芐敏感的ler基因缺失突變菌株,并用PCR進行鑒定。用045(△ler)細菌培養(yǎng)上清進行Vero細胞毒性實驗,結(jié)果表明045ler基因缺失突變菌株對Vero細胞沒有毒性作用,而野生型045對Vero細胞具有較強的毒性作用。為了評價045(△ler)突變菌株的安全性,建立了045感染的小鼠動
4、物模型,對第一組小鼠口服接種045(△ler),同時對第二組同齡小鼠口服接種野生型045。第二組小鼠體重減輕,并于4天內(nèi)全部死亡,剖檢及病理切片檢查腎臟、肝臟、肺臟和腸均出現(xiàn)明顯病理變化。第一組小鼠生長正常,體重與陰性對照組小鼠相似,沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀,14天后剖檢,各器官均未見病理變化。結(jié)果證實所構(gòu)建的EPEC045ler基因缺失突變菌株無致細胞病變作用,并喪失了對小鼠動物模型的致病性,該菌株有可能成為預(yù)防豬EPEC045感染的基因
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