腸致病性大腸桿菌045 ler基因缺失突變菌株的構(gòu)建及其特性的研究.pdf

1、腸致病性大腸桿菌是能引起動物體內(nèi)出血性和非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥的主要病原菌。最常見的菌株是o45，而o45的一個重要毒力特征是引起腸黏膜粘附和脫落損傷(A/E)，EPEC的主要毒力因子定位于致病島(PathogenicityIsland，PAIs)和腸細胞脫落位點(The Locusofenterocyte effacement，LEE)上，其DNA長度為43kp，分LEEl，LEE2，LEE3，和LEE4四個基因區(qū)，

2、LEEl包含ler(中心調(diào)節(jié)基因，LEE-encodedregulator)，ler對LEE毒力基因群(LEE2、LEE3和LEE4)的表達起正調(diào)控作用，因此認為ler是EPEC毒力因子表達重要的中心調(diào)節(jié)基因。 在本研究中，構(gòu)建了045的ler基因缺失突變菌株并對其特性進行了研究：首先用PCR的方法擴增出缺失279bpler的基因片段，將其克隆到自殺性載體pCVD442中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCVD442：：△ler，轉(zhuǎn)化到宿主菌S

3、M10pir，然后通過接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將自殺質(zhì)粒pCVD442：：△ler從SM10pir轉(zhuǎn)到0157：H7中，轉(zhuǎn)導(dǎo)子過夜培養(yǎng)后鋪平板，通過蔗糖篩選氨芐敏感的ler基因缺失突變菌株，并用PCR進行鑒定。用045(△ler)細菌培養(yǎng)上清進行Vero細胞毒性實驗，結(jié)果表明045ler基因缺失突變菌株對Vero細胞沒有毒性作用，而野生型045對Vero細胞具有較強的毒性作用。為了評價045(△ler)突變菌株的安全性，建立了045感染的小鼠動

4、物模型，對第一組小鼠口服接種045(△ler)，同時對第二組同齡小鼠口服接種野生型045。第二組小鼠體重減輕，并于4天內(nèi)全部死亡，剖檢及病理切片檢查腎臟、肝臟、肺臟和腸均出現(xiàn)明顯病理變化。第一組小鼠生長正常，體重與陰性對照組小鼠相似，沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀，14天后剖檢，各器官均未見病理變化。結(jié)果證實所構(gòu)建的EPEC045ler基因缺失突變菌株無致細胞病變作用，并喪失了對小鼠動物模型的致病性，該菌株有可能成為預(yù)防豬EPEC045感染的基因