中國特有小型豬內源性反轉錄病毒的檢測與全基因克隆.pdf

1、臨床上，供體器官的嚴重短缺，使人們將目光轉向了異種移植。目前為止，豬被認為是最適合的異種移植供體。但研究發(fā)現，以前病毒DNA形式整合進豬體細胞基因組中的豬內源性反轉錄病毒(porcineendogenousretrovirus，PERV)在體外能夠感染多種人源細胞，這引起了人們對異種移植安全性的廣泛關注。我國有著豐富的小型豬種資源，目前已經開展豬-人異種器官/組織移植的相關研究，但有關小型豬中PERV的攜帶、表達情況以及內源性釋放毒株的

2、生物學特性方面報道甚少，因此有必要開展這方面的研究工作，了解我國小型豬中PERV存在的本底，為異種器官受體提供安全可靠的器官，同時通過構建細胞感染模型與全基因克隆，為進一步研究PERV的生物學特性及PERV對人源細胞的感染機制搭建技術平臺。為此本研究主要進行以下四個方面的工作： (1)中國特有小型豬PERV存在情況的普查 采集了6個省市10個單位、5個品種、17個豬群259份血樣，通過PCR檢測發(fā)現：我國小型豬基因組中普

3、遍存在PERV，其陽性率達100％。其中以B亞型最高(95.37％)，其次為A亞型(67.18％)、C亞型(42.08％)，目前為止沒有篩選到無PERV的陰性豬個體。PERV主要結構蛋白基因gag、pol、env不僅在小型豬基因組中存在，而且都能夠轉錄為RNA。除了檢測不到PERV-C亞型病毒的表達外，大部分A、B亞型病毒都能夠表達，且A亞型的表達率高于B亞型。值得注意的是我國小型豬中各種PERV亞型病毒混合存在的現象十分普遍，有78.

4、38％存在2種以上PERV亞型病毒混合感染，因此小型豬中存在不同PERV亞型病毒重組的可能性。 (2)不同PERVHEK293細胞感染模型的建立 利用本實驗室已經建立的G418抗性HEK293細胞(G418R293)，將五指山豬(WZS)、中國實驗小型豬(ZGSY)、巴馬香豬(BMXZ)、巴馬小型豬(BM)及貴州香豬(GZ)外周血淋巴細胞分別與G418R293細胞共培養(yǎng)，通過G418加壓篩選，除去共培養(yǎng)體系中的豬外周血淋

5、巴細胞，然后應用PCR及RT-PCR的方法對所制備的感染細胞模型進行系統鑒定。通過上述方法己成功建立了5個來自小型豬外周血淋巴細胞的PERVHEK293細胞感染模型，證實了豬外周血淋巴細胞來源的PERV在體外也能夠感染人源細胞系，為研究PERV的生物學特性及病原安全性的評價搭建了技術平臺。 (3)PERV-WZS株等病毒全基因組序列測定 本研究利用PCR及RACE技術完成了五指山小型豬、巴馬小型豬及來源于HEK293細胞

6、感染模型的豬內源性反轉錄病毒的全基因組序列測定，3個毒株的大小分別為8639bp、8595bp、8689bp。分型檢測均為PERV-A亞型病毒。遺傳進化分析表明PERV-WZS與PERV-A亞型毒株遺傳關系最近，其次為PERVC型及PERV-B亞型。通過序列比較及生物信息學分析發(fā)現PERV-WZS的5′UTR區(qū)中啟動子及增強子的位置分別位于-67～+1及-97～-59之間。PERV-Env蛋白中有18個可能的抗原表位區(qū)，7個可能的糖基化

7、位點。來源于HEK293細胞的嗜人293-PERV-WZS株與親本病毒PERV-WZS同源性為94.6％，差別主要在5′UTR及gag基因。PERV-BM株5′UTR結構與PERV-WZS株明顯不同，可能是進化年代相對短的毒株。 (4)PERV-WZS株全長cDNA克隆的構建 依據已經測定的PERV-WZS株全基因組序列，分5段設計覆蓋全長的5對重疊引物。應用RT-PCR技術擴增出其全基因組cDNA片段，將5個重疊片段通