內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體(mEBP9)的聚乙二醇定點(diǎn)修飾及其穩(wěn)定性和拮抗內(nèi)毒素效應(yīng)研究.pdf

1、革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)是臨床上導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和膿毒癥(sepsis)的主要原因。目前SIRS或者膿毒癥仍然具有較高的發(fā)病率和死亡率，現(xiàn)階段防治革蘭氏陰性桿菌引起的SIRS或者膿毒癥主要依賴于抗生素控制感染，但對(duì)內(nèi)毒素血癥(Endotoxemia)的療效并不理想。
　　 脂

2、多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)具有放大LPS毒性的作用。LBP的氨基端含有特異性LPS結(jié)合位點(diǎn)；LBP的第91-108位氨基酸序列是已知的結(jié)合LPS能力很強(qiáng)的氨基酸序列(Endotoxin binding peptide，EBP)。在本課題組前期工作中，為增強(qiáng)EBP的拮抗LPS生物活性，通過對(duì)EBP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改建，從11條內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體(mutant of EBP，mEB

3、P)中篩選出拮抗LPS作用較強(qiáng)的第9條內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體(mEBP9)。鑒于普通多肽在體內(nèi)容易被降解，生物半衰期較短，而經(jīng)聚乙二醇修飾的多肽在體內(nèi)比未經(jīng)修飾的多肽可能具有較高的穩(wěn)定性和較好的保護(hù)效應(yīng)；本研究在mEBP9的氨基端或者羧基端引入一個(gè)半胱氨酸(mEBP9-SH)，通過mEBP9-SH上的巰基加成到mPEG-MAL(甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺)的雙鍵上，實(shí)現(xiàn)對(duì)mEBP9進(jìn)行聚乙二醇定點(diǎn)修飾。
　　 我們課題組通過生物合成途

4、徑已經(jīng)獲得mEBP9、PEG-NH-mEBP9以及PEG-COOH-mEBP9，觀察PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9的拮抗LPS活性并篩選出拮抗LPS效應(yīng)更強(qiáng)的PEG-NH-mEBP9；在此基礎(chǔ)上比較PEG-NH-mEBP9與mEBP9的體內(nèi)外拮抗LPS活性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示1、5、10、20μmol/L的mEBP9、PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP

5、9對(duì)RAW264.7細(xì)胞均無可見的細(xì)胞毒性。
　　 2.PEG-NH-mEBP9抑制LPS誘導(dǎo)的TAL活化效應(yīng)明顯強(qiáng)于同濃度的PEG-COOH-mEBP9(P<0.01)；PEG-NH-mEBP9抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6作用優(yōu)于等濃度的PEG-COOH-mEBP9。
　　 3.10μmol/L的PEG-NH-mEBP9或mEBP9在-20℃放置30天后抑制LPS誘導(dǎo)的TAL活化能力大于

6、在37℃放置30天后的PEG-NH-mEBP9或mEBP9；10μmol/L的mEBP9在-20℃環(huán)境放置30天后抑制LPS誘導(dǎo)的TAL活化能力大于等濃度的PEG-NH-mEBP9；10μmol/L的PEG-NH-mEBP9在37℃環(huán)境放置30天后抑制LPS誘導(dǎo)的TAL活化作用明顯強(qiáng)于同濃度的mEBP9(P<0.05)。LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞3h、6h、12 h后，5μmol/L的mEBP9抑制RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α

7、效應(yīng)均強(qiáng)于同一時(shí)相點(diǎn)同濃度的PEG-NH-mEBP9；LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h、36h、48h后，5μmol/L的PEG-NH-mEBP9的抑制RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α能力反而都強(qiáng)于同一時(shí)相點(diǎn)等濃度的mEBP9。
　　 4.PEG-NH-mEBP9與mEBP9體外拮抗LPS生物活性比較：mEBP9抑制LPS誘導(dǎo)的TAL活化效應(yīng)強(qiáng)于同濃度的PEG-NH-mEBP9；mEBP9抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7

8、細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6作用明顯優(yōu)于等濃度的PEG-NH-mEBP9(P<0.05)。
　　 5.PEG-NH-mEBP9和mEBP9體內(nèi)拮抗LPS效應(yīng)比較：(1)提高模型小鼠生存率：“LPS/D-GalN”組48 h內(nèi)全部死亡，“mEBP9+LPS/D-GalN”組和“PEG-NH-mEBP9+LPS/D-GalN”組48 h生存率分別為為40%和60%。(2)減少血漿TNF-α和IL-6水平：LPS/D-GalN處理后9

9、0 min，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明顯抑制小鼠體內(nèi)血漿TNF-α/IL-6分泌(P<0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的效應(yīng)顯著強(qiáng)于mEBP9(P<0.05)。(3)減少血清ALT和AST水平：LPS/D-GalN處理后6h，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明顯抑制小鼠體內(nèi)血清ALT/AST活性(P<0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS活性明顯強(qiáng)于mEBP9(P<0.05)。(4)

10、減輕小鼠肝臟病理組織學(xué)改變：“LPS/D-GalN”組肝臟有明顯的病理學(xué)改變，包括肝細(xì)胞壞死，充血，肝組織結(jié)構(gòu)的破壞，肝竇內(nèi)大量的炎癥細(xì)胞聚集；“LPS/D-GalN+mEBP9”組肝臟組織壞死的區(qū)域和壞死程度均降低，而且炎癥細(xì)胞浸潤減少；“LPS/D-GalN+PEG-NH-mEBP9”組肝臟病理組織學(xué)改變程度比“LPS/D-GalN+mEBP9”組輕。
　　 主要研究結(jié)論：PEG-NH-mEBP9拮抗LPS效應(yīng)優(yōu)于PEG-C