IL-18在大鼠腎移植中的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、近年來免疫抑制劑的研究得到了很大的發(fā)展，并在臨床應(yīng)用中取得良好的效果，但移植后急性排斥反應(yīng)仍然是導(dǎo)致移植腎功能喪失的重要原因。因此，急性排斥反應(yīng)的早期診斷、干預(yù)和誘導(dǎo)免疫耐受，對移植腎功能的恢復(fù)具有重要意義。隨著對急性排斥反應(yīng)中移植物分子生物學(xué)的深入研究，細(xì)胞因子在器官移植急性排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中的作用得到廣泛重視。移植術(shù)后對某些細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行檢測并干預(yù)以防治急性排斥反應(yīng)是當(dāng)前器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 目前IL—2在腎移植急性

2、排斥反應(yīng)中的作用已得到充分的闡明，通過抑制IL—2受體能有效的預(yù)防急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床移植中阻斷IL—2/IL—2受體不能完全控制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，說明機(jī)體內(nèi)存在有獨(dú)立于IL—2/IL—2受體系統(tǒng)之外的其它T細(xì)胞激活途徑。但對于其它細(xì)胞因子的激活途徑研究較少。IL—18是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子。IL—18作為IFN—γ的誘導(dǎo)因子，在調(diào)節(jié)免疫方面具有重要的作用，主要參與Th1的調(diào)節(jié)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在不同的免

3、疫微環(huán)境下，IL—18對Th2也具有誘導(dǎo)作用。在移植免疫中，Th1細(xì)胞主要參與免疫排斥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞主要參與免疫耐受，而IL—18作為Th1和Th2細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，在器官移植中具有重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)在肝臟、腎臟、心臟和骨髓移植的急性排斥反應(yīng)早期有IL—18的高表達(dá)，說明IL—18參與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。雖然對腎移植早期急性排斥反應(yīng)是IL—18和iNOS的檢測在國內(nèi)外已有研究報(bào)道，但對于IL—18在腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中的

4、作用以及它與其它細(xì)胞因子的相互作用和穿孔素、iNOS在移植腎中的損傷機(jī)制報(bào)道較少，有待進(jìn)一步的研究，特別是關(guān)于抗IL—18抗體在大鼠腎移植中誘導(dǎo)免疫耐受，在國內(nèi)外未見有報(bào)道。 本研究創(chuàng)新之處在于：（1）關(guān)于IL—18在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中可能通過和IL—12的協(xié)同作用，激發(fā)IFN—γ的大量釋放，抑制IL—10的產(chǎn)生，促使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th1轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，在國內(nèi)外未見報(bào)道；（2）最近在國外有關(guān)于大

5、鼠腎移植中IL—18和iNOS參與移植腎的損傷的報(bào)道，但關(guān)于IL—18、穿孔素和iNOS共同參與大鼠移植腎急性排斥反應(yīng)中的損傷機(jī)制未見有報(bào)道。（3）在大鼠腎移植排斥反應(yīng)中使用抗IL—18抗體誘導(dǎo)免疫耐受在國際上是首次報(bào)道。 本研究在構(gòu)建大鼠腎移植模型的基礎(chǔ)上探討IL—18、IFN—γ、IL—12、IL—10、iNOS和穿孔素在腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)變化，以及抗IL—18抗體對急性排斥反應(yīng)的干預(yù)作用。研究分四個(gè)部分：

6、第一部分 大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)模型的建立 目的：建立穩(wěn)定可靠的大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)（AR）模型，為大鼠腎移植AR基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。 方法：異系移植組由雄性Wistar大鼠為供體，雄性SD大鼠為受體。同系移植組供受體均為SD大鼠。在顯微鏡下，采用標(biāo)準(zhǔn)的供受體動(dòng)靜脈端端吻合，供體輸尿管—膀胱瓣和受體膀胱吻合。于腎移植術(shù)后第3、5、7天收集心臟血行BCr及BUN檢測，移植腎組織行HE染色光鏡下觀察病理改變，參照Banff9

7、7標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行AR嚴(yán)重程度的半定量評分。 結(jié)論：采用此方法，可減少對受體循環(huán)系統(tǒng)的影響及避免尿路狹窄。SD大鼠間組織相容性高，SD大鼠作為供受體的大鼠腎移植排斥反應(yīng)輕微，可作為同系對照組：Wistar—SD大鼠間腎移植AR發(fā)生快，程度重，是良好的AR動(dòng)物模型。該模型穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，適合于移植免疫雌礎(chǔ)研究。 第二部分 IL—18在大鼠腎移植中誘導(dǎo)IFN—γ導(dǎo)致急性排斥反應(yīng) 目的：通過比較動(dòng)態(tài)觀察IL—18、IL—1

8、2、IFN—γ和IL—10在大鼠腎移植術(shù)后移植腎mRNA表達(dá)和血清中濃度變化，以及IL—18在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，探討IL—18在急性排斥反應(yīng)中對Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響及IL—12和IL—18在急性排斥反應(yīng)中的協(xié)同作用。 方法：建立大鼠腎移植模型，將大鼠分為三組：同系移植組（Syn組）（SD—SD）（n=24）；急性排斥反應(yīng)組（AR組）（Wistar—SD）（n=24）； CsA組：（Wistar—SD）（n=24）。于

9、移植術(shù)后第1d、3d、5d、7d，每組處死受體鼠各6只，收集受體鼠的血液、移植腎和脾臟。分別采用ELISA和Real—time PCR檢測血液中IL—18、IL—12、IFN—γ和IL—10濃度和移植腎組織中IL—18、IL—12、IFN—γ和IL—10 mRNA表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀檢測術(shù)后第7d IL—18在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)論：在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中，IL—18主要來源于巨噬細(xì)胞，可能通過和NK細(xì)胞分泌的IL—12協(xié)

10、同作用，激發(fā)IFN—γ的大量產(chǎn)生，抑制IL—10的產(chǎn)生，促使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th1轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。 第三部分 IL—18在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中誘導(dǎo)iNOS和穿孔素的殺傷作用 目的：通過比較動(dòng)態(tài)觀察IL—18、IFN—γ、iNOS和穿孔素在大鼠腎移植模型中移植腎mRNA表達(dá)和血中濃度變化，以及穿孔素在CD8+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，探討IL—18、IFN—γ、iNOS和穿孔素在大鼠腎移植急性排斥反

11、應(yīng)中對移植腎組織的損傷機(jī)制。 方法：建立大鼠腎移植模型，將大鼠分為三組：同系移植組（Syn組）（SD—SD）（n=24）；急性排斥反應(yīng)組（AR組）（Wistar—SD）（n=24）； CsA組：（Wistar—SD大鼠）（n=24）。于移植術(shù)后第1d、3d、5d、7d，每組處死受體鼠各6只，收集受體鼠的血液、移植腎和脾臟。分別采用ELISA和Real—time PCR檢測血液中IL—18、IFN—γ、NO和穿孔素濃度和移植腎組織

12、中IL—18、IFN—γ、iNOs和穿孔素mRNA表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀檢測穿孔素在CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)。同時(shí)切取部分移植腎組織作病檢。 結(jié)論：在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中，IL—18可能通過巨噬細(xì)胞分泌的IFN—γ的產(chǎn)生，誘導(dǎo)iNOS對移植腎組織、細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。同時(shí)通過CD8+T淋巴細(xì)胞上調(diào)穿孔素的表達(dá)造成移植腎組織的損傷。 第四部分 抗IL—18抗體在大鼠腎移植中誘導(dǎo)免疫耐受 目的：通過在大鼠腎移植組中使

13、用抗IL—18抗體，觀察IL—18、IFN—γ、IL—10、iNOS和穿孔素在急性排斥反應(yīng)期大鼠腎移植組中外周血mRNA表達(dá)變化及各組受體鼠的存活時(shí)間，探討抗IL—18抗體在急性排斥反應(yīng)的阻斷及免疫耐受的誘導(dǎo)。 方法：建立大鼠腎移植模型，將大鼠分為五組：同系移植組（Syn組）（SD—SD）（n=12）；急性排斥反應(yīng)組（AR組）（Wistar—SD）（n=12）；CsA組：（Wistar—SD大鼠）（n=12）；抗IL—18組：（

14、Wistar—SD大鼠）（n=12）；抗IL—18+CsA組：（Wistar—SD大鼠）（n=12）。觀察各組平均生存時(shí)間。于移植術(shù)后第5d、7d、14d和20d尾靜脈收集受體鼠外周血并檢測BCr。采用Real—time PCR檢測術(shù)后第5d和7d外周血IL—18、IFN—γ、IL—10、iNOS和穿孔素mRNA表達(dá)變化。 結(jié)論：通過抗IL—18抗體對大鼠腎移植中IL—18的阻斷可誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。其發(fā)生機(jī)制可能是通過下調(diào)IL