新生大鼠HIBD遠期神經功能和超微結構改變及早期運動訓練對其影響的相關研究.pdf

1、研究背景:
　　 新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是指各種圍產期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導致胎兒或新生兒腦損傷，臨床出現(xiàn)一系列中樞神經系統(tǒng)異常的表現(xiàn)，是引起新生兒急性死亡和慢性神經系統(tǒng)損傷的主要原因之一，將遺留諸多后遺癥，如腦性癱瘓、智力低下、癲癇及發(fā)育遲緩等。隨著新生兒重癥監(jiān)護室的建立和醫(yī)療技術水平的提高，許多中、重度缺氧缺血性腦損傷患兒得以生存，但

2、存活兒永久性腦功能障礙發(fā)病率仍較高。HIBD是一種彌漫性損傷，病變主要在大腦海馬、皮層、紋狀體、基底節(jié)、丘腦等部位，發(fā)病機制較復雜，是由多種機制綜合作用所致的一系列生化連鎖反應或稱缺氧缺血性瀑布的結果。目前臨床上對于新生兒HIBD治療多采用對癥處理、營養(yǎng)支持及早期干預等綜合治療，尚缺乏特效、經濟的方法來治療新生兒HIBD，因此深入探究HIBD機制和修復機制，尋找有效的防治措施，對于提高新生兒HIBD存活率，減少存活兒遠期神經系統(tǒng)后遺癥，

3、提高我國人口質量均有重要意義。
　　 新生兒處在大腦發(fā)育關鍵期，而且新生兒HIBD具有非進行性、無持續(xù)性的缺血缺氧因素存在等特點，生后7dSD大鼠腦與新生兒腦發(fā)育相似，而且造成一過性腦缺氧缺血條件也與HIBD相似，因此，國內外以生后7d新生SD大鼠為研究對象，參照Rice方法，建立新生鼠HIBD動物模型，該模型被廣泛應用于研究HIBD相關課題。在上述基礎上，利用動物模型，深入探討HIBD后的損傷機制，了解缺氧缺血對新生大鼠遠期神

4、經功能和超微結構的影響，探索合理、全面的判斷預后和評估療效的方法，進一步尋求有效、經濟的干預措施，并探討干預措施的修復機制。
　　 HIBD是一種彌漫性損傷，由于HIBD致病因素的復雜性，加上嬰幼兒腦發(fā)育的特殊性和可塑性，臨床上要準確地評價HIBD的遠期預后及干預療效相當困難，許多患兒的預后與急性期損傷的嚴重程度并無一致的線性相關。而目前關于HIBD動物實驗研究中，對于HIBD遠期預后及干預措施療效的評價多停留在行為學及上述兩個

5、腦區(qū)損傷后常規(guī)病理學改變的觀察上，鮮有超微結構的研究。突觸是神經元和效應細胞之間傳遞信息的功能部位，與行為學表現(xiàn)之間關系密切，也是腦發(fā)育可塑性的核心。因此，觀察突觸超微結構的改變不僅可以深入探究HIBD機理及修復機制，還可以了解其與行為學之間的相關性，從而有望對HIBD遠期預后及干預療效做出早期客觀的評價。
　　 目前對于新生兒HIBD的治療措施主要有高壓氧、亞低溫、神經營養(yǎng)藥物及一般支持對癥處理，高壓氧治療方法受醫(yī)院條件設備限

6、制、早期病情程度亦影響其應用，且治療時間窗、療程尚無統(tǒng)一定論等，而亞低溫治療方法不僅療效不確定，而且應用范圍較為局限，神經營養(yǎng)藥物目前研究報道僅提示對疾病急性期有一定效果，且治療費用高，影響其在臨床上的應用。運動訓練是指通過病人自身力量或治療師的輔助操作或借助于器械所進行的主動或被動運動以改善局部或全身功能為目的的一種治療方法。因其實施方便、費用低、治療可長期堅持并可在家中實施，在臨床上已應用于新生兒HIBD的治療，取得一定療效，但其具

7、體機制尚未完全明確。一方面因為新生兒大腦正處在發(fā)育關鍵期，存在著較強可塑性，對損傷有一定自身修復能力，臨床上很難判斷患兒的進步是否與此干預治療相關。另外，研究表明，適時適量的運動訓練不僅能改善運動功能，而且可以提高人和動物的學習記憶能力。新生兒HIBD除運動功能障礙外，許多伴有智力低下、感覺統(tǒng)合失調等問題，早期運動訓練是否也能改善患兒這些功能呢？是通過何種可能途徑改善的呢？
　　 據研究報道，適宜的運動訓練可以引起中樞神經系統(tǒng)內

8、cAMP、Ca2+等第二信使適量增加，從而誘導c-fos基因表達，控制下游靶基因的轉錄，從而合成新的蛋白質。在正常情況下，c-fos蛋白參與細胞生長、分化、信息傳遞、學習和記憶等生理過程，它對于編碼記憶，形成大多數的長時程增強（Long-termpotentiation，LTP）有著十分重要的作用，而LTP是神經元可塑性的反映。因此，有利于大腦的記憶功能，這為運動對學習記憶的促進作用在分子水平上提供一個證據。
　　 已有研究指出

9、突觸素(p38)是突觸重建的重要標志，因為p38參與神經元發(fā)育和分化過程。發(fā)育中神經元p38的表達優(yōu)先于突觸的構成，即在突觸結構形成之前就已經有p38存在和表達，隨著神經元發(fā)育成熟、突觸成熟，p38的表達也相應增加。p38還直接參與了突觸的形成及調節(jié)與突觸相關的其它突觸蛋白的表達。因此該蛋白被廣泛用于標記突觸終末。
　　 基于以上理論，本研究采用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型，觀察大鼠遠期行為學、病理學及超微結構的改變，探

10、索HIBD機制，重點觀察超微結構的改變及其意義，指導HIBD遠期預后及療效評估。之后早期給予運動訓練干預，觀察其對新生大鼠HIBD遠期運動、學習記憶能力及感覺功能的療效，并利用免疫組織化學方法檢測c-fos、突觸素的表達，來初步探索其療效機制。
　　 具體研究內容包括以下兩個部分:
　　 第一部分:構建新生大鼠HIBD動物模型，觀察遠期行為學及超微結構改變
　　 目的:
　　 建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷

11、（Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD）模型，觀察遠期行為學及超微結構改變，提供HIBD遠期功能評價方法及指導臨床治療。
　　 方法:
　　 60只7日齡新生SD大鼠隨機分為HIBD組和假手術組，每組30只。生后5周進行Morris水迷宮及感覺功能測試;取腦組織切片行尼氏染色計數神經元數目;取皮層、海馬行透射電鏡，觀察突觸結構、測量突觸后致密區(qū)厚度及活性區(qū)長度，并與行為學結果進行相關分析。

12、r>　　 結果:
　　 Morris水迷宮測試中，HIBD組大鼠尋找平臺潛伏期時間明顯長于假手術組（P＜0.05）;HIBD組大鼠穿越平臺次數較假手術組少（P＜0.05）。HIBD組感覺運動功能測試結果明顯差于假手術組。尼氏染色提示HIBD組神經元數目明顯減少（P＜0.01）。電鏡顯示，HIBD組大鼠突觸數量減少，突觸后致密區(qū)厚度及活性區(qū)長度變薄變短。HIBD組大鼠海馬突觸后致密區(qū)厚度與Morris水迷宮尋找平臺潛伏期時間呈負

13、相關（r=-0.861，P=0.006），與三項感覺功能評估得分之和呈負相關性(r=-0.758，P=0.029)。
　　 結論:
　　 缺氧缺血可致新生鼠遠期神經元減少和超微結構損傷，造成遠期行為學功能障礙，超微結構改變在一定程度上優(yōu)于病理觀察，有助于更好評估預后和評價療效，基于未成熟腦突觸的可塑性，在腦發(fā)育關鍵期指導臨床治療。
　　 第二部分:早期運動訓練對新生大鼠HIBD遠期神經功能的影響
　　 目

14、的:
　　 探討早期運動訓練對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷遠期病理、超微結構、神經功能的影響。
　　 方法:
　　 90只7日齡SD大鼠隨機分為運動組、對照組和假手術組。運動組和對照組建立HIBD模型，運動組于HIBD后1周開始每天給予抓握、旋轉、行走、平衡等訓練。4周后檢測各組大鼠神經功能評分、空間學習記憶和皮層感覺功能、透射電鏡觀察突觸和神經元超微結構，HE染色觀察腦組織病理改變，尼氏染色計數神經元數目，并檢測突

15、觸素、c-fos表達水平。
　　 結果:
　　 運動組神經功能評分、空間學習記憶、皮層感覺功能均優(yōu)于對照組，和假手術組間差異無統(tǒng)計學意義。透射電鏡下對照組大鼠海馬和皮層突觸損傷嚴重，神經氈區(qū)突觸減少，突觸前膨大腫脹、輪廓不清晰，突觸小泡溶解空泡形成，PSD變薄、薄厚不均，而運動組未見明顯異常。HE染色提示對照組神經元數目明顯減少，可見腫脹壞死細胞，運動組與假手術組比較未見明顯異常，尼氏染色提示對照組神經元數目明顯減少，與