傷寒沙門菌質粒pRST98和毒力基因spv對巨噬細胞自噬和凋亡的影響及分子機制研究.pdf

1、目的:通過細胞感染模型，研究傷寒沙門菌質粒pRST98和沙門菌質粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene，spv)對巨噬細胞(macrophage)自噬和凋亡的影響及其分子機制。
　　 方法:
　　 一.傷寒沙門菌質粒pRST98對巨噬細胞自噬和凋亡的影響及分子機制研究。
　　 以攜帶pRST98的傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi

2、，S.typhi)野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-⊿pRST98和將pRST98經接合轉移重新導入ST8-⊿pRST98所獲得的回補株ST8-c-pRST98感染人巨噬細胞THP-1，以此作為感染模型，分別用自噬誘導劑雷帕霉素( Rapamycin，RAPA)和NO合酶抑制劑L-硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）進行干預。將細菌和細胞共培養(yǎng)30 min后吸除上清，此時

3、定為“0點”，加入含100μg/ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)的培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌，然后將AMK濃度降為10μg/ml抑制從感染細胞中釋放至培養(yǎng)液中的細菌生長，繼續(xù)培養(yǎng)至各檢測時間點。分別在細胞感染模型的0點、感染后2h和6h收集細胞或上清液。用流式細胞術(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測巨噬細胞自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubuleassociated protein1 light chain

4、3，LC3)-Ⅱ的表達和Sub-G1凋亡峰，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察細胞超微結構的變化，Western blot法檢測巨噬細胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，比色法測定Caspase-3的活性，Griess法檢測NO(nitric oxide)含量，ELISA法檢測TNF-α含量，平板菌落計數(shù)法檢測胞內活菌數(shù)。
　　 二.沙門菌質粒毒力基因sp

5、v對巨噬細胞自噬和凋亡的影響及分子機制研究。
　　 由于傷寒沙門菌只感染人類的嚴格宿主特異性，缺乏理想的動物模型，為今后進一步在動物活體內研究pRST98上spv的功能，本部分實驗使用鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S.typhimurium）開展相應實驗，以攜帶sPv的鼠傷寒沙門菌野生株UF009和敲除spv的鼠傷寒沙門菌突變株UF110感染鼠巨噬細胞J774A.1

6、，以此作為感染模型，并用p38抑制劑SB203580進行干預。細菌和細胞共培養(yǎng)1h后吸除上清，此時定為“0點”，AMK的應用同第一部分。分別在細胞感染模型的0點、感染后2h、6h和24 h收集細胞或上清液進行相關指標的檢測。用FCM檢測巨噬細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達和Sub-G1凋亡峰，Western blot法檢測巨噬細胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，Griess法檢測NO的含量。
　　 結果:

7、>　　 一.傷寒沙門菌質粒pRST98對巨噬細胞自噬和凋亡的影響及分子機制研究。
　　 1.FCM和Western blot檢測自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1結果顯示，細胞感染模型的0點，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達量均顯著低于ST8-⊿pRST98組;感染后2h，各感染組細胞LC3-Ⅱ(P＞0.05)和Beclin-1的表達量未見明顯差異。
　　

8、2.FCM檢測Sub-G1凋亡峰結果顯示，感染后2h，各感染組細胞凋亡率未見明顯差異(P＞0.05);感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞凋亡率顯著高于ST8-⊿pRST98組(P＜0.01)。電鏡結果與FCM檢測結果一致，感染后2h，各感染組細胞均可見染色質邊聚等凋亡改變，但各組細胞的凋亡現(xiàn)象未見明顯差異;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組凋亡細胞明顯多于ST8-⊿pRST98感染組。Western

9、blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2，亦發(fā)現(xiàn)感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞Bcl-2表達量顯著低于ST8-⊿pRST98組。
　　 3.比色法檢測Caspase-3活性結果顯示，感染后2h，各感染組細胞Caspase-3活性未見明顯差異（P＞0.05）;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞Caspase-3活性高于ST8-⊿pRST98組（P＜0.05）。
　　 4.細胞上清液中NO

10、和TNF-α測定結果顯示，感染后2h和6h，ST8和ST8-cpRST98感染組細胞NO(P＜0.01)和TNF-α（2h，P＜0.01;6h，P＜0.05）產生量均低于ST8-⊿pRST98感染組。而平板菌落計數(shù)法檢測細胞內活菌數(shù)結果顯示，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞內活菌數(shù)高于ST8-⊿pRST98感染組（2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)。
　　 5.用自噬誘導劑RARA干預后，ST8和ST8-c-pR

11、ST98感染組細胞的凋亡率(P＜0.01)和細胞內活菌數(shù)降低(2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)，而ST8-⊿pRST98感染組未見明顯變化(P＞0.05)。
　　 6.用NO合酶抑制劑L-NAME干預后，ST8-⊿pRST98感染組細胞LC3-Ⅱ表達量顯著下降(P＜0.01)，凋亡率(P＜0.01)和Caspase-3活性(P＜0.05)上升，而ST8和ST8-c-pRST98感染組未見明顯變化(P＞0.05)。

12、　　 二.沙門菌質粒毒力基因sPv對巨噬細胞自噬和凋亡的影響及分子機制研究。
　　 1.FCM和Western blot檢測自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1結果顯示，細胞感染模型的0點，UF009感染組細胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達量均顯著低于UF110感染組;感染后2h，UF009和UF110感染組細胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表達量未見明顯差異。
　　 2.用p38的

13、抑制劑SB203580干預后，細胞感染模型的0點，UF009感染組細胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表達量未見明顯變化，而UF110感染組細胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達量顯著下降。
　　 3.FCM檢測Sub-G1凋亡峰結果顯示，感染后2h，UF009和UF110感染組細胞凋亡率未見明顯差異(P＞0.05);感染后6h和24 h，UF009感染組細胞凋亡率顯著高于UF110感染組(P＜0.

14、01)。Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2結果顯示，感染后2h，UF009和UF110感染組細胞Bcl-2的表達量未見明顯差異;感染后6h，UF009感染組細胞Bcl-2的表達量略低于UF110感染組，兩組之間差異不顯著;感染后24 h，UF009感染組細胞Bcl-2的表達量顯著低于UF110感染組。
　　 4.用p38的抑制劑SB203580干預后，F(xiàn)CM結果顯示，感染后6h和24 h，UF009感染組細胞凋亡率

15、未見明顯變化(P＞0.05)，而UF110感染組細胞凋亡率上升(P＜0.05); Western blot結果顯示，感染后24 h，UF009感染組細胞Bcl-2表達量未見明顯變化，而UF110感染組細胞Bcl-2表達量顯著下降。
　　 5.Griess法檢測細胞上清液中NO結果顯示，感染后2h、6h和24 h，UF009感染組細胞NO產生量均顯著低于UF110感染組(P＜0.01)。
　　 6.用p38抑制劑SB203

16、580干預后，各時間段UF009感染組細胞NO產生量未見明顯變化(P＞0.05)，而UF110感染組細胞NO產生量顯著降低(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 以上實驗結果表明，傷寒沙門菌質粒pRST98在感染早期通過抑制巨噬細胞自噬抵抗殺菌作用，使細菌在細胞內的活菌數(shù)量增加，而在后期則誘導細胞凋亡。用自噬誘導劑RAPA干預細胞感染模型并激活自噬，能夠減輕攜帶pRST98的傷寒沙門菌誘導的巨噬細胞凋亡。pRST98對巨