miRNA對(duì)共刺激分子CD80、CD86及其受體在消化道腫瘤中表達(dá)的調(diào)控作用及臨床意義.pdf

1、前言
　　活化的T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤、抗感染和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞的活化不僅需要T細(xì)胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復(fù)合物作用產(chǎn)生的第一信號(hào)，還需要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的B7家族協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號(hào)。協(xié)同刺激分子與其受體結(jié)合產(chǎn)生正性或負(fù)性信號(hào)。協(xié)同刺激分子CD80和CD86與其受體CD28結(jié)合產(chǎn)生正性信號(hào)，或與其受體CTLA-4結(jié)合提供負(fù)性信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，進(jìn)而調(diào)控機(jī)

2、體的免疫反應(yīng)。協(xié)同刺激分子CD80和CD86表達(dá)在APC細(xì)胞上，而在多數(shù)的腫瘤組織及細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，從而不能有效的誘導(dǎo) T細(xì)胞的活化，引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)結(jié)直腸癌小鼠模型發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞低表達(dá)CD80分子的是其逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制，并且這與低表達(dá)CD80分子的未成熟的DC細(xì)胞的作用機(jī)制相似。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合

3、，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因翻譯，在基因表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用。目前多數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中異常表達(dá)的miRNA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖以及凋亡從而影響腫瘤微環(huán)境。
　　第一部分人結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的miRNA對(duì)CD80、CD86及其受體分子表達(dá)的調(diào)控作用
　　【目的】探討在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的 miRNA對(duì) CD80、CD86及其受體分子表達(dá)的調(diào)控作用。
　　【方法】首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定6例結(jié)直腸癌中CD80、CD

4、86的表達(dá)量，并對(duì)其進(jìn)行分析。然后，采用miRNA芯片技術(shù)測(cè)定6例結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中 miRNA的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析癌組織中異常表達(dá)的 miRNA。在這些miRNA中，使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能與CD80、CD86及受體CD28、CTLA-4基因3?-UTR作用的miRNA；并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)有作用的miRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)。最后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析這些miRNA對(duì)CD80、CD86及受體

5、CD28、CTLA-4基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　【結(jié)果】（1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示CD80、CD86的mRNA水平在結(jié)直腸癌及癌旁的表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。（2）結(jié)直腸癌組織中有30條miRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織，有8條miRNA的表達(dá)明顯低于癌旁組織；其中上調(diào)的miR-21、miR-34a可能與CD80基因3?-UTR結(jié)合，miR-21、miR-31、miR-34a和miR-181b可能與CD86基因3?-UTR結(jié)合，miR

6、-31、miR-34a、miR-181b、miR-20b和miR-142-3p可能與CD28基因3?-UTR結(jié)合；表達(dá)下調(diào)的miR-140-3p、miR-143、miR-145和miR-378可能與 CTLA-4基因3?-UTR結(jié)合。（3）構(gòu)建了含 CD80、CD86與受體CD28、CTLA-4基因3?-UTR的熒光素酶重組載體，通過(guò)酶切和基因測(cè)序的方法驗(yàn)證正確。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)的 miR-21、miR-31

7、、miR-20b和miR-142-3p可以分別與CD80、CD86和CD28基因3?-UTR結(jié)合，而下調(diào)表達(dá)的miR-378和miR-145可以與CTLA-4基因3?-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)。
　　【結(jié)論】結(jié)直腸癌組織中，miR-21、miR-31、miR-20b和miR-142-3p等miRNA表達(dá)上調(diào)，抑制了CD80、CD86和CD28的蛋白表達(dá)；而下調(diào)表達(dá)的miR-378和miR-145可以抑制CTLA-4的蛋白表達(dá)，從而介

8、導(dǎo)了腫瘤免疫逃逸。這為研究腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和尋找到新的抗腫瘤靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 CD80基因3?-UTR內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究
　　【目的】研究CD80基因3?-UTR內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與胃癌發(fā)生的相關(guān)性。
　　【方法】收集了183例胃癌患者以及348例正常人的外周血樣本。首先，運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出位于CD80基因3?-UTR的SNP位點(diǎn)；然后預(yù)測(cè)CD80基因3?-UTR內(nèi)可

9、能存在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)；最后，篩選出位于預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的，且較小等位基因頻率(MAF)大于10%的SNP進(jìn)行研究。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度分析法（PCR-RFLP）檢測(cè)了樣本中CD80基因3?-UTR內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性基因型分布，并統(tǒng)計(jì)分析基因型與胃癌發(fā)生及患者病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】（1）CD80基因3?-UTR上存在21個(gè)SNP位點(diǎn)，MAF大于10%的SNP有rs1599795、rs15997

10、96、rs17281703、rs57271503和rs7628626，其中rs1599795位于3條預(yù)測(cè)的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，因此選取該SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究。（2）統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與TT型純合子相比，TA型雜合子患胃癌的危險(xiǎn)性更高（OR=1.44，95% CI=0.98-2.11），并且A等位基因攜帶者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性顯著高于TT純合子（P=0.036）。（3）SNP rs1599795基因型與胃癌的腫瘤面積、腫瘤發(fā)生位置、腫瘤浸潤(rùn)深度、

11、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM分期等參數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。
　　【結(jié)論】CD80基因3?-UTR上的SNP位點(diǎn)rs1599795與胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)，該SNP基因型與多種胃癌病理參數(shù)的相關(guān)，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些研究結(jié)果為闡明CD80在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的重要作用奠定了基礎(chǔ)。
　　小結(jié)
　　本論文主要探討了結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的 miRNA對(duì)協(xié)同刺激分子 CD80、CD86及其受體分子CD28和CT

12、LA-4表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，人結(jié)直腸癌組織中miR-21、miR-31、miR-20b和miR-142-3p表達(dá)顯著升高，分別與CD80、CD86和CD28基因的3?-UTR結(jié)合，而miR-378和miR-145表達(dá)下調(diào)，可以與CTLA-4基因的3?-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，參與腫瘤免疫逃逸。此外，研究發(fā)現(xiàn)CD80基因3?-UTR內(nèi)的SNP位點(diǎn)rs1599795與胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)，并與胃癌的腫瘤面積、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等