siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86對(duì)IL-4的影響.pdf

1、研究背景:
　　 支氣管哮喘(哮喘)是由多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘的患病率和病死率在全球呈逐年上升趨勢(shì)，哮喘的治療給患者帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的最有效藥物，但是長(zhǎng)期使用激素會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，有些患者病情嚴(yán)重，用激素不能很好的控制，少部分患者會(huì)出現(xiàn)激素治療無(wú)效(激素抵抗型哮喘)，因此我們有必要尋找新的哮喘防治的方法。
　　 哮喘的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其中最經(jīng)典、最重要的免疫

2、學(xué)異常是Th1/Th2細(xì)胞失衡，主要表現(xiàn)為Th2型細(xì)胞數(shù)量的增多和功能亢進(jìn)，T細(xì)胞在誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。T細(xì)胞的活化需要抗原提呈細(xì)胞(Antigen PresentingCell，APC)提供的刺激信號(hào)，樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是體內(nèi)最主要的APC，是唯一初始型免疫反應(yīng)細(xì)胞，也是最強(qiáng)大的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)物，它能捕獲并呈遞抗原，啟動(dòng)和誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，在平衡免疫激活和免疫耐受中起著重要作用。CD80/CD

3、86是表達(dá)于DC表面的共刺激分子，高表達(dá)共刺激分子CD80/CD86的成熟DC(mDC)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，低表達(dá)共刺激分子CD80/CD86的未成熟DC(imDC)抑制T細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。許多研究發(fā)現(xiàn)DC表面CD80/CD86的表達(dá)與Th2細(xì)胞反應(yīng)及哮喘氣道炎癥有著密切的關(guān)系。
　　 RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，普遍存在于真核細(xì)胞中，是真核細(xì)胞對(duì)抗外源基因侵入及自身基因異常表達(dá)

4、的一種重要防御機(jī)制，具有高特異性、高效性、傳遞性以及時(shí)間依賴性等特點(diǎn)。1998年由Fire等首次發(fā)現(xiàn)[11]，以后陸續(xù)有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究。小分子干擾核糖核酸(siRNA)作為近年研究的熱點(diǎn)，不僅被用作探討細(xì)胞基因功能的工具，而且更吸引人的是應(yīng)用siRNA抑制致病基因的表達(dá)，并開發(fā)出治療各類疾病的新型基因藥物。RNAi目前已被廣泛用于抗病毒、抗腫瘤等方面的研究，其應(yīng)用于樹突細(xì)胞和哮喘的防治近年國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，應(yīng)用siRNA阻斷哮

5、喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86對(duì)T淋巴細(xì)胞分化影響的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究通過(guò)應(yīng)用siRNA抑制哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)，觀察siRNA是否對(duì)哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)具有抑制作用，探討siRNA干擾哮喘小鼠DC的CD80、CD86后對(duì)Th2型細(xì)胞因子IL-4的影響，從而為RNA干擾應(yīng)用于哮喘治療提供新的靶位，為哮喘的基因治療開辟新

6、的途徑。
　　 研究目的:
　　 第一部分建立一種從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)高純度樹突狀細(xì)胞(DC)的有效方法，并在體外進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。
　　 第二部分應(yīng)用siRNA阻斷DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，探討siRNA是否對(duì)哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)具有抑制作用及siRNA干擾哮喘小鼠DC的CD80、CD86后對(duì)Th2型細(xì)胞因子IL-4的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1

7、、小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(DC)的分離、培養(yǎng)、鑒定。
　　 1.1體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓DC
　　 健康6-8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠，斷頸處死，無(wú)菌取出股骨和脛骨，用RMPI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖出骨髓，離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用含10％的FBS的RMPI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至6孔板，加入rmGM-CSF和rmIL-4，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后首次全量

8、換液，去除懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充細(xì)胞因子，以后隔日半量換液并補(bǔ)足細(xì)胞因子，培養(yǎng)至第7天，收集懸浮細(xì)胞，收集前1天加入LPS，可獲得成熟DC(mDC)。
　　 1.2小鼠骨髓DC的鑒定
　　 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)記的表達(dá)。
　　 2、siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86對(duì)IL-4的影響
　　 健康6-8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠20只，隨機(jī)分為

9、2組，分別為正常對(duì)照組、哮喘模型組，每組10只。哮喘模型組雞卵白蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏，OVA溶液霧化吸入激發(fā)。正常對(duì)照組以生理鹽水替代OVA溶液。光鏡下觀察支氣管、肺組織病理變化。分離培養(yǎng)哮喘小鼠骨髓DC，設(shè)計(jì)合成CD80、CD86相關(guān)siRNA序列并轉(zhuǎn)染哮喘小鼠DC，熒光定量RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾前后DC中CD80、CD86mRNA的表達(dá)和表面標(biāo)記物CD80、CD86蛋白的表達(dá)，分離健康小鼠T細(xì)胞。將干擾組、未

10、干擾組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組的DC分別與小鼠T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA檢測(cè)上清液中Th2分泌因子IL-4的含量。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:
　　 所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、小鼠骨髓DC的培養(yǎng)、鑒

11、定
　　 小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)rm GM-CSF、rm IL-4和LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的DC具有典型的樹突狀形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)imDC細(xì)胞和mDC細(xì)胞均可高表達(dá)CD11c，達(dá)80％以上，mDC細(xì)胞的CD80、CD86、MHCⅡ的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(73.63±8.01)％、(75.85±11.72)％、(84.17±10.91)％，顯著高于imDC組細(xì)胞的(37.53±9.82)％、(38.29±8.76)％、(68.16±11.92

12、)％(P＜0.05)。
　　 2、siRNA阻斷哮喘小鼠樹突細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86對(duì)IL-4的影響siRNA轉(zhuǎn)染小鼠DC后，CD80、CD86mRNA表達(dá)水平明顯降低[(2.09±0.46)vs(0.60±0.17)，(3.58±0.20)vs(0.91±0.48)，P＜0.05]，CD80、CD86陽(yáng)性表達(dá)率顯著減低[(82.45±15.80)％vs(30.79±7.07)％，(89.45±10.22)％vs(27.

13、29±6.99)％，P＜0.05]，DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中IL-4表達(dá)水平明顯下降[(150.69±29.50)pg/ml vs(93.04±13.13)pg/ml，P＜0.05]。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 1、小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)GM-CSF、IL-4和LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可獲得足量較高純度具有典型形態(tài)特征的DC，為進(jìn)一步研究DC的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、哮喘小鼠DC高表達(dá)CD80、CD86，siR