鼠疫耶爾森氏菌蛋白對宿主NF-κB通路的影響及YpkA激酶活性的研究.pdf

1、目的：
　　1.病原菌的入侵通常引起宿主 NF-κB信號通路的活化，鼠疫菌蛋白 SycE、YscL、YscS是T3SS的組成成分，YscL是為T3SS轉(zhuǎn)運效應蛋白提供能量的YscN ATTPase的調(diào)控蛋白；YscS是分泌裝置的成分蛋白。通過檢測鼠疫菌蛋白 SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL對宿主NF-κB信號通路的影響，對初步研究鼠疫菌可能的致病機制提供依據(jù)。
　　2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)

2、效應蛋白，VASP是人的一種細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，通過體外驗證YpkA對VASP的磷酸化作用，對鼠疫菌的致病可能的機制進行初步的探討。
　　方法：
　　1. LB液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌，試劑盒提取其基因組DNA。設計引物，PCR擴增yscL基因，插入pCMV-Myc質(zhì)粒，構建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-yscL，經(jīng)測序分析正確后大量提取質(zhì)粒，去內(nèi)毒素后用于轉(zhuǎn)染293T細胞。
　　2.大量提取本實驗室已構建好的表達S

3、ycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞。
　　3.利用瞬時轉(zhuǎn)染技術，將以上提取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入293T細胞，以anti-Myc抗體為一抗，WB方法檢測以上5種蛋白在293T細胞中的表達。表達正確后，再分別與表達螢火蟲熒光素酶的pBII-LUC質(zhì)粒和表達海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。然后用TNF-α刺激293T細胞，在化學發(fā)光板上檢測熒光素酶的

4、活性。
　　4.在大腸桿菌BL21中表達YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B?珠子純化YpkA；在293T細胞中表達VASP，F(xiàn)lag珠子純化VASP。將純化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶緩沖液混合，30℃反應30min，設立陽性和陰性對照組，分別用WB和同位素標記法檢測VASP的磷酸化。
　　5.統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析實驗結(jié)果，統(tǒng)計方法為方差分析。
　　結(jié)果：
　　1.序

5、列分析結(jié)果顯示pCMV-Myc-yscL構建正確。
　　2. WB結(jié)果顯示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T細胞中得到正確表達。
　　3.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：SycE、YPO3877、YscS和YscL實驗組的熒光素酶活性比陰性對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；YPO2940組熒光素酶活性比陰性對照組沒有降低，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4. WB