間歇低氧對(duì)肝臟低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種常見(jiàn)的睡眠呼吸紊亂性疾病，與高血壓、冠心病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，嚴(yán)重者可危及生命[1～3]。有研究證實(shí)，OSAS患者血脂譜異常，表現(xiàn)為甘油三脂（Triglycerides，TG）、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、極低密度脂蛋白(Very low density l

2、ipoprotein，VLDL)、低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein，LDL)均明顯升高，而高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)則降低，表明OSAS患者脂質(zhì)代謝紊亂與其心血管疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[4-7]。
　　在OSAS患者中，由于夜間睡眠時(shí)反復(fù)出現(xiàn)呼吸停止，會(huì)導(dǎo)致低氧血癥、高碳酸血癥及睡眠質(zhì)量低下，上述結(jié)果能引起呼吸、心血管、精神神經(jīng)、血液、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的病理生理

3、變化。因此，睡眠中間歇低氧(Intermittent hypoxia，IH)是OSAS病理生理機(jī)制的關(guān)鍵。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給予小鼠IH5天后，其血清TC、HDL及TG的水平增加，而4周之后LDL的水平亦增加[8,9]，且血脂升高的程度與低氧刺激的嚴(yán)重度呈正比[8]。因此，IH可能是OSAS患者高脂血癥的直接原因。
　　低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related pr

4、otein1，LRP1)是一種內(nèi)吞性的多功能受體，廣泛分布于肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中含量最豐富。能識(shí)別多種配體并在體內(nèi)清除之。LRP1首先與其配體結(jié)合成復(fù)合物并被內(nèi)吞入細(xì)胞，形成內(nèi)體，然后配體在溶酶體內(nèi)水解，LRP1則再回到細(xì)胞膜循環(huán)使用。LRP1在肝細(xì)胞表面的主要作用是與載脂蛋白E和乳糜微粒殘粒結(jié)合，LRP1還可以清除富含TG的脂蛋白殘粒，比如乳糜微粒殘粒和VLDL殘粒。因此，LRP1在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重

5、要的作用。缺氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor1，HIF-1）是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核蛋白，它與靶基因結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，使機(jī)體產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)反應(yīng)。在機(jī)體缺氧狀態(tài)下可以誘導(dǎo)HIF-1的表達(dá)增加。HIF-1α是HIF-1的活性亞基。有研究表明，給予人平滑肌細(xì)胞低氧刺激后，其細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加，從而進(jìn)一步引起LRP1的表達(dá)增加[10]。
　　上述研究結(jié)果強(qiáng)烈提示，IH條件下肝細(xì)胞內(nèi)HIF-1α及

6、LRP1的水平也可能發(fā)生上述變化，且LRP1的升高可能是通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的。本研究通過(guò)建立大鼠及人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞系IH模型，模擬OSAS患者的主要病理生理變化。(1)評(píng)價(jià)不同作用時(shí)間的IH對(duì)大鼠血脂的影響以及IH條件下大鼠肝臟LRP1與HIF-1α的變化。(2)評(píng)價(jià)IH條件下人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞系LRP1以及HIF-1α的變化，并探討該變化的可能機(jī)制。(3)評(píng)價(jià)IH條件下給予阿托伐他汀(Atorvastatin，A)

7、干預(yù)后人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞系LRP1以及HIF-1α的變化，探討阿托伐他汀治療OSAS脂質(zhì)代謝紊亂的又一可能機(jī)制。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　成年雄性SD大鼠，體重300-350g，分為五組，1周組(1w)、2周組(2w)、3周組(3w)，4周組(4w)和對(duì)照組(C)，通過(guò)IH裝置進(jìn)行IH干預(yù)。干預(yù)后留取肝臟、血清標(biāo)本。
　　二、人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞系
　　體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系，分成

8、3部分進(jìn)行:一部分細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行IH干預(yù);一部分細(xì)胞先用YC-1進(jìn)行預(yù)處理，然后再IH干預(yù);第三部分細(xì)胞應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)后進(jìn)行IH干預(yù)。以上組別均設(shè)定空白對(duì)照。留取干預(yù)后的細(xì)胞進(jìn)行分析。
　　三、Real-time RT-PCR
　　采用Trizol試劑提取大鼠肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞系中的總RNA，利用Real-timeRT-PCR試劑盒進(jìn)行Real-time RT-PCR，應(yīng)用7500Fast Real-Time

9、PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，并分析結(jié)果。
　　四、Western-blot
　　將總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，配置一抗稀釋液LRP11∶500，HIF-1α1∶500，β-actin1∶5000。將條帶應(yīng)用TTBS略加清洗后分別放入一抗稀釋液中，搖床上4℃雜交過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2000)搖床上室溫雜交1h后，ECL法顯影。
　　五、統(tǒng)計(jì)分析
　　用S

10、PSS18.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、IH大鼠體重和進(jìn)食量的變化
　　每組大鼠初始體重之間不存在顯著差異，體重均隨著時(shí)間的推移逐漸增加，且各組之間體重增加的幅度一致，各組之間在相同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體重的比較，未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異（P＞0.05）。
　　二、IH大鼠血清TG、TC、LDL、HDL的變化
　　大鼠血清HDL在IH干預(yù)達(dá)到3周時(shí)出現(xiàn)了升高，在第4周時(shí)

11、進(jìn)一步升高。大鼠血清TC在IH干預(yù)達(dá)到3、4周時(shí)出現(xiàn)了升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。大鼠血清LDL隨著IH干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然有逐漸上升的趨勢(shì)，但各組之間進(jìn)行比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠血清TG在IH干預(yù)達(dá)到4周時(shí)出現(xiàn)了升高，與對(duì)照組和干預(yù)1周組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　三、IH大鼠肝臟LRP1、HIF-1α蛋白的變化
　　LRP1蛋白在IH2周后即出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的升高，并保持升高水平至4周。

12、HIF-1α蛋白則從IH1周開始就出現(xiàn)升高，且維持在升高狀態(tài)。
　　四、IH干預(yù)后HepG2細(xì)胞LRP1和HIF-1α的變化
　　與對(duì)照組比較，IH干預(yù)后的HepG2細(xì)胞LRP1 mRNA和蛋白，HIF-1αmRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。
　　五、YC-1聯(lián)合IH干預(yù)后HepG2細(xì)胞LRP1和HIF-1α的變化
　　與IH組相比，IH+YC-1組HepG2細(xì)胞LRP1 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下

13、降(P＜0.05)。IH+YC-1組HepG2細(xì)胞HIF-1αmRNA的表達(dá)與IH組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而HIF-1α蛋白的表達(dá)與IH組相比明顯下降(P＜0.05)。
　　六、給予阿托伐他汀(A)干預(yù)后，間歇低氧條件下HepG2細(xì)胞LRP1和ⅢF-1α的表達(dá)變化
　　與IH組相比，IH+A組LRP1 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高;與IH+A組相比，IH+A+YC-1組LRP1 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低。

14、與IH組相比，IH+A組HIF-1α mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變，但HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯升高。與IH+A組相比，IH+A+YC-1組的HIF-1α蛋白表達(dá)明顯的下降。
　　結(jié)論：
　　1.IH導(dǎo)致大鼠部分血脂指標(biāo)HDL、TG、TC升高，但不伴有體重和進(jìn)食量的相應(yīng)變化，且IH對(duì)血脂HDL、TG、TC的影響呈時(shí)間依賴性。
　　2.IH條件下大鼠肝臟LRP1和HIF-1α的表達(dá)水平明顯升高，且HIF-1α的升高先于LRP

15、1的升高。
　　3.IH條件下，人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞LRP1和HIF-1α的表達(dá)明顯增加。
　　4.給予HIF-1α特異性抑制劑YC-1處理后，人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)明顯下降，同時(shí)LRP1的表達(dá)也明顯減少。證實(shí)IH引起的LRP1表達(dá)上調(diào)是通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的。
　　5.給予阿托伐他汀干預(yù)后，IH作用下的HepG2細(xì)胞HIF-1αmRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，但HIF-1α的蛋白水平明顯增加