人ⅠκBαM真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠肝移植缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景與目的：肝臟移植是終末期肝病患者目前唯一有效的治療方法，但仍有諸多問(wèn)題尚待解決：如何提高移植肝的活性、移植肝與受體的匹配、術(shù)后缺血再灌注損傷、免疫抑制藥物的應(yīng)用以及移植肝的再生和影響因素等。其中肝臟移植后缺血再灌注損傷是早期的急性損傷，導(dǎo)致肝臟功能的損害、加重排斥反應(yīng)的強(qiáng)度，甚至引起移植后原發(fā)性無(wú)功能。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)是近年來(lái)研究較為深入的調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的一種關(guān)鍵因子。NF-

2、κB調(diào)控的基因編碼急性時(shí)相蛋白、細(xì)胞因子和細(xì)胞粘附分子等。通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)，NF-κB參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進(jìn)程。研究表明，肝移植缺血再灌注損傷過(guò)程中，NF-κB的激活導(dǎo)致其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，即炎性介質(zhì)的大量表達(dá)，從而在移植后缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，可以設(shè)想抑制NF-κB的激活有望調(diào)節(jié)或減輕缺血再灌注損傷。 細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，它與一

3、類抑制因子IκB(IκBs)結(jié)合組成為一異源三聚體。其中p50-p65-IκBα或IκBB是NF-κB/IκB結(jié)合的主要形式。三聚體中IκB家族抑制因子的存在可阻礙p50，p65復(fù)合物的核易位及DNA結(jié)合能力，從而使NF-κB的活性喪失。當(dāng)細(xì)胞受到TNF，PMA等NF-κB激活劑刺激時(shí)，，激活I(lǐng)κB激酶(IκBkinase，IKK)，IKK催化IκBs的Ser32/36磷酸化后，隨之泛素化及酶解。IκBs從三聚體中解離出來(lái)，暴露出p50

4、亞基上的易位信號(hào)和p65亞基上的DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而使此異二聚物表現(xiàn)出NF-κB活性，并從細(xì)胞質(zhì)中易位到細(xì)胞核中，與κB基序(κBmotif)相結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 研究表明IκBα的Ser32/36兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)任一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生點(diǎn)突變，可使IκBα不被IKK磷酸化及降解，從而特異性的結(jié)合NF-κB，阻遏NF-κB的異常激活。因此，我們應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)點(diǎn)突變?nèi)薎κBα絲氨酸(Ser36)為丙氨酸(Ala36

5、)，構(gòu)建真核表達(dá)載體PcDNA3.0-IκBαM，在大鼠肝移植過(guò)程中將PcDNA3.0-IκBαM轉(zhuǎn)染供體肝臟，觀察PcDNA3.0-IκBαM對(duì)大鼠肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 材料和方法： 1.研究對(duì)象：健康雄性SD大鼠，體重200-250g。 2.研究方法：穩(wěn)定建立大鼠肝移植模型。應(yīng)用RT-PCR和重疊延伸PCR技術(shù)，得到點(diǎn)突變的人IκBαM，定向克隆至PcDNA3.0真核表達(dá)載體。將SD大鼠隨機(jī)分四組

6、：Ⅰ假手術(shù)組：僅行大鼠開關(guān)腹手術(shù)；Ⅱ組：空白對(duì)照組(單純行肝臟原位移植，未行任何處理)；Ⅲ組：PcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組(供體肝臟在移植前兩天行PcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染)；Ⅳ組：PcDNA3.0-IκBαM轉(zhuǎn)染組(供體肝臟在移植前兩天行PcDNA3.0-IκBαM轉(zhuǎn)染)；術(shù)后2h，12h，24h，3d各時(shí)點(diǎn)分別處死各組大鼠取材。取外周血全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝臟酶學(xué)(ALT)；對(duì)肝臟標(biāo)本進(jìn)行光鏡觀察；利用肝組織免疫組織化學(xué)、Weste

7、rnBlot和RT-PCR檢測(cè)組織內(nèi)NF-κBp65、TNF-α、ICAM-1在各時(shí)點(diǎn)蛋白和mRNA的表達(dá)水平；ELISA測(cè)定大鼠血清中TNFα的含量。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，各時(shí)間點(diǎn)組間比較采用獨(dú)立T檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為差異具有顯著性意義。 結(jié)果： 1.大鼠肝移植手術(shù)存活率達(dá)93.3％，一周存活率81.7％。 2.肝臟

8、組織病理顯示移植組肝小葉肝竇明顯充血腫脹，小葉內(nèi)可見明顯肝細(xì)胞氣球樣變性；免疫組化顯示移植組NF-κB激活細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組 3.經(jīng)酶切和DNA序列測(cè)定鑒定，證實(shí)重組質(zhì)粒PcDNA3.0-IκBαM構(gòu)建正確。 4.與PcDNA3.0-IκBαM轉(zhuǎn)染組相比較，空白對(duì)照組和PcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組肝臟酶學(xué)指標(biāo)升高具有明顯差異，術(shù)后12小時(shí)為最為顯著；血清TNF-α含量于移植后2h，12h具有明顯差異，以2h最為顯著；免

9、疫組織化學(xué)，Western-blot和NF-PCR在不同水平檢測(cè)上均提示NF-κB、TNF-α和ICAM-1在PcDNA3.0-IκBαM轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯少于空白對(duì)照組和PcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？瞻讓?duì)照組和PcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)組與移植各組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.縮短無(wú)肝期、預(yù)防圍手術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生是術(shù)后存活的關(guān)鍵。肝移植缺血再灌注早期即有NF-κB的激活。