拓撲異構酶Ⅱα基因失活與苯致造血細胞損傷關系的研究.pdf

1、研究苯及代謝物對體外培養(yǎng)正常人骨髓單個核細胞和臨床苯中毒患者骨髓單個核細胞ToPoⅡα表達和活性的影響.探討ToPoⅡα表達的調控機制即ToPoⅡα啟動子、啟動子調控因子組蛋白乙酰化、甲基化水平改變.觀察染苯人群或氫醌接觸后骨髓單個核細胞ToPo Ⅱα mRNA水平的動態(tài)變化,探索TOPOⅡα啟動子開始出現(xiàn)變化的時間.為更進一步認識苯中毒相關疾病的發(fā)病機理及相關疾病的診療提供一定的依據(jù). 方法： 1.Western Bl

2、ot法測定苯及代謝物對人骨髓單個核細胞ToPo Ⅱα含量變化的影響. 2.DNA超螺旋解旋法檢測撲異構酶Ⅱ的活性:運用ToPo Ⅱ檢測試劑盒檢測去連環(huán)動質DNA(]kDNA)的水平. 3.RT-PCR檢測體外氫醌(苯代謝產物)處理實驗及臨床苯中毒病例ToPo Ⅱα mRNA水平的變化. 4.構建染色質免疫沉淀分析法(ChIP):在活細胞狀態(tài)下,用甲醛固定蛋白質-DNA復合物,然后用機械(超聲波)的手段將其隨機切斷

3、為一定長度范圍內的染色質小片段.利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合體,然后沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段.經(jīng)蛋白質與DNA解偶聯(lián),DNA片段純化等處理后,用PCR等方法檢測與蛋白質的結合的DNA情況. 5.應用chIP技術,探討TOPOⅡα含量變化的可能機制:運用特異性抗體,檢測TOPOⅡα含量變化及ToPoⅡα啟動子及啟動子調控因子(SPl、ATF-2、SP3、NF-YA

4、、NF-M、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90)組蛋白H3,H4 乙?；癏3K4,H3K9甲基化水平改變的關系. 6.RT-PCR測定臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動子各調控因子mRNA表達水平的改變. 7.RT-FCR檢測氫醌(苯代謝產物)接觸不同時間后骨髓單個核細胞ToPoⅡα mRNA水平的動態(tài)變化,應用ChIP技術,探討TOPOⅡα啟動子開始出現(xiàn)變化. 結果： 1.體外實驗氫醌誘導的正常

5、人骨髓單個核細胞中TOPO Ⅱα含量較正常對照組明顯下降,具有顯著的統(tǒng)計學意義.(P<0.01). 2.體外氫醌誘導組及臨床苯中毒病例實驗檢測表明TOPO Ⅱα活性較對照組明顯受到抑制. 3.體外氫醌誘導組及臨床苯中毒病例實驗檢測表明TOPO Ⅱα mRNA水平較對照組明顯下降,具有顯著的統(tǒng)計學意義.(P<0.01). 4.成功構建染色質免疫沉淀分析法(ChIP). 5.體外氫醌誘導實驗表明TOPOⅡα含

6、量降低與TOPOⅡα啟動子組蛋白H4乙酰化水平、H3K4甲基化水平降低及H3K9甲基化水平升高有關:而臨床苯中毒病例實驗研究則顯示TOPOⅡα含量降低不僅與TOPOⅡα啟動子組蛋白H4乙?；健3K4甲基化水平降低及H3K9甲基化水平升高有關還與組蛋白H3乙?；浇档陀嘘P.進一步的臨床苯中毒病例研究提示TOPO Ⅱα含量下降與TOPO Ⅱα啟動子調控因子(SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、C-MYB、C-J

7、UN、ICBP90)組蛋白甲基化及乙?；礁淖冇嘘P:SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H4、H3乙?；较陆? C-JUN組蛋白H4、H3乙?；綗o明顯改變;NF-YA、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降,SP1、ATF-2、SP3、NF-M、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變;SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高,而ATF-2、SP

8、3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變. 6.臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動子各調控因子mRNA表達水平的改變:與正常對照組相比,mRNA表達水平降低的有SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN, ATF-2、ICBP90mRNA表達水平不變而SP3、P53mRNA表達水平則升高. 7.氫醌(苯代謝產物)接觸不同時間后骨髓單個核細胞TOPOⅡα mRNA

9、水平呈動態(tài)下降,4h時mRNA水平下降開始出現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P<0.01),ChIP后發(fā)現(xiàn)3.5h時TOPOⅡα啟動子己出現(xiàn)改變(組蛋白乙?；疕4水平). 結論：1.苯及其代謝物導致人骨髓單個核細胞TOPOⅡα的表達(蛋白含量、mRNA水平)及活性受抑,與所致的造血細胞損傷有關.2.TOPOⅡα表達下降的機制與TOPOⅡα啟動子及部分啟動子調控因子組蛋白H4、H3乙?；?組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平改變有關.3.氫醌接觸