FGF8b對上皮-間質表型轉化的調控及對前列腺癌侵襲轉移影響的研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在歐美，尤其在美國前列腺癌的發(fā)病率仍超過肺癌，高居第一位；而在我國前列腺癌的發(fā)病率呈快速增長趨勢。腫瘤的浸潤和轉移是導致前列腺癌患者死亡的主要原因，前列腺癌細胞如何獲得侵襲轉移潛能目前尚不十分清楚。因此探討前列腺癌侵襲轉移的分子機制，尋找新的抑制其侵襲轉移的治療靶點有重要的理論意義和臨床實用價值。本課題擬先在組織學水平，利用免疫組織化學技術方法檢測FGF8b、上皮標志物(E—cadhe

2、rin)、間質標志物(Vimentin)在前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)手術標本中的表達情況，并探討FGF8b表達與前列腺癌臨床病理學因素的相關性以明確FGF8b表達在前列腺癌侵襲轉移過程中的可能作用。然后，選用DU145前列腺癌細胞株作為體外實驗的靶細胞，用RT-PCR、Western blotting等方法檢測上皮標志物和間質標志物在FGF8b轉染前列腺癌細胞株前后的改變以探討FGF8b能否誘導前列腺癌細胞發(fā)生上皮-間質表型轉化

3、(EMT)，以及對作用后前列腺癌細胞株遷移及侵襲能力的影響，最后探討FGF8b誘導前列腺癌細胞發(fā)生上皮-間質表型轉化(EMT)的分子機制。通過本實驗研究，將初步揭示前列腺癌中FGF8b表達意義及其促前列腺癌侵襲轉移的可能機制，并尋找在該過程中發(fā)揮重要作用的關鍵因子，為干預前列腺癌侵襲轉移提供新的有效靶點。
　　 目的：探討FGF8b、E—cadherin和Vimentin在前列腺癌和BPH中的表達情況，并研究這三種蛋白與前列腺癌

4、臨床分期和病理分級的關系，從而為后續(xù)研究打下一定基礎。
　　 材料和方法：20例BPH標本(55—78歲，平均62.4歲)和49例前列腺癌標本(61-82歲，平均67.3歲)取自中南大學湘雅醫(yī)院泌尿外科2002—2009年的手術標本及經(jīng)直腸穿刺活檢存檔蠟塊，標本系10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。前列腺癌標本按照Gleason評分。前列腺癌患者術前均未接受內分泌治療或其他治療。標本4μm厚連續(xù)切片，分別做FGF8b、E—cadh

5、erin和Vimentin免疫組化染色，分析其表達水平與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關系。
　　 結果：49例前列腺癌組織標本中，共有33例表達不同程度的FGF8b，陽性表達率為67.35％(33/49)；20例BPH組織標本中，無一例檢測到FGF8b表達。在前列腺癌組織和BPH組織中FGF8b的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在前列腺癌組織中有22例標本E—cadherin表達缺失(22/49，44.90％)，27例(27/4

6、9，55.10％)陽性表達；Vimentin有29例(29/49，59.18％)表達陽性。統(tǒng)計分析顯示，上皮標志物E—cadherin在前列腺癌組織中的表達缺失，以及間質標志物Vimentin的陽性表達均與前列腺癌的臨床分期和病理分級顯著相關(P<0.05)；FGF8b表達與前列腺癌的臨床腫瘤分期和病理分級顯著相關(P<0.05)，并且與E—cadherin表達缺失和vimentin陽性表達相關(P<0.05)。
　　 結論：<

7、br>　　 (1)人前列腺癌組織中有FGF8b表達，且其表達與前列腺癌臨床分期和病理分級相關；
　　 (2)上皮標志物E-cadherin的表達缺失以及間質標志物Vimentin的陽性表達均與前列腺癌的臨床分期和病理分級相關；
　　 第二章、FGF8b對上皮-間質表型轉化的調控及對前列腺癌細胞DU145生物學特性影響的研究
　　 目的：研究FGF8b基因轉染對前列腺癌細胞侵襲和轉移的影響，探討其與上皮-間質表型

8、轉化的關系。
　　 方法：以前列腺癌細胞株DU145為研究對象，利用脂質體介導轉染技術將FGF8b基因轉染DU145細胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定高表達FGF8b的FGF8b/DU145細胞模型：采用RT—PCR， Western-blot，MTT比色法以及Transwell小室等分子生物學技術和方法，深入研究FGF8b對DU145細胞上皮-間質表型轉化相關標志物表達的影響及對腫瘤細胞侵襲、遷移能力的影響。
　　 結果：成

9、功建立了FGF8b穩(wěn)定高表達的細胞模型(FGF8b/DU145)：FGF8b轉染DU145細胞后，細胞變長，細胞-細胞間隙增寬；通過RT—PCR、western-blot等方法進一步檢測了FGF8b轉染前列腺痛細胞前后上皮、間質標志物表達的改變，發(fā)現(xiàn)轉染組細胞中上皮標志物E—cadherin的表達水平與DU145細胞及PcDNA3.1-DU145細胞相比較顯著降低，而間質標志物Vimentin在轉染組細胞中的表達顯著高于對照組；細胞遷移

10、和細胞侵襲試驗結果顯示，F(xiàn)GF8b轉染DU145細胞后，細胞遷移和侵襲能力顯著高于對照組.
　　 結論：
　　 (1)FGF8b轉染DU145細胞后，DU145細胞的侵襲遷移能力增強：
　　 (2)FGF8b促進前列腺癌侵襲轉移的機制可能是誘導前列腺痛細胞發(fā)生上皮-間質表型轉化(EMT)。
　　 第三章、FGF8b調控前列腺癌細胞上皮間質表型轉化的分子機制研究
　　 目的：探討FGF8b促進前列腺

11、癌DU145細胞上皮間質表型轉化的分子機制
　　 方法：western-blot檢測各組細胞ERK1/2通路活性，然后將FGF8b/DU145細胞及DU145細胞在PD98059(ERK激酶MEK1抑制劑)作用下培養(yǎng)兩天，每天光鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化，最后Western-blot以及Transwell小室等方法，檢測各組細胞EMT相關標志物的變化以及細胞的遷移能力改變。
　　 結果：FGF8b/DU145組ERK1/2

12、活性明顯高于對照組，給予PD98059(ERR激酶MEK1抑制劑)后，上皮細胞標志物E—cadherin蛋白表達量與對照組相比明顯上調(P<0.05)；間質標志物Vimentin表達量明顯下調(P<0.05)；細胞遷移試驗結果提示，在給予PD98059后，F(xiàn)GF8b/DU145組細胞的遷移能力較對照組明顯減弱。
　　 結論：FGF8b調控前列腺癌細胞DU145發(fā)生上皮-間質表型轉化(EMT)可能由ERK激酶通路介導， MEK1作