缺氧對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402多藥耐藥性的調(diào)控及HIF-1αRNAi對(duì)MDR1的干涉作用.pdf

1、研究背景：原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前治療肝癌的方法是以手術(shù)、化療和放療為主的綜合性治療。由于肝癌不屬于對(duì)化療敏感的腫瘤，全身化療的效果較差，無(wú)論是單個(gè)化療藥物的應(yīng)用或是聯(lián)合應(yīng)用，效果均不理想。腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是臨床惡性腫瘤化療的主要障礙，也是腫瘤患者化療失敗，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原因之一。因此多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)方法的研究成為科學(xué)家們的研究重點(diǎn)。 HIF-1 是一個(gè)普遍存在

2、于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的缺氧應(yīng)答調(diào)控因子。在惡性腫瘤低氧微環(huán)境中處于重要的中樞調(diào)節(jié)地位，其調(diào)控的下游靶基因40種，除涉及腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展、侵襲、腫瘤細(xì)胞凋亡、血管生成外，還導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵杭，其表達(dá)水平對(duì)惡性腫瘤的化療敏感性與預(yù)后具有重要的影響。 傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)MDR的藥物由于逆轉(zhuǎn)劑量對(duì)機(jī)體的副作用極大而在臨床應(yīng)用中受到限制，多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制和有效逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)的研究成為極具價(jià)值的攻克腫瘤和腫瘤耐藥的關(guān)鍵，因此尋找新的針對(duì)肝癌多藥耐藥的目的

3、基因是急待研究的課題。對(duì)腫瘤缺氧微環(huán)境與多藥耐藥關(guān)系的研究有助于發(fā)現(xiàn)多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，并為癌癥治療和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供新的作用位點(diǎn)和治療途徑。 而RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年興起的高效且特異特定基因的新技術(shù)，主要是將21bp的小干擾RNA(small rferenceRNA,siRNA)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，通過(guò)序列特異的降解作用，能有效封閉靶mRNA 和降低蛋白質(zhì)水平。 第一部分，目的：探討HIF

4、-1α、PTEN和P-gp在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，以及與臨床病理因素及相互的關(guān)系。 方法：用免疫組化法檢測(cè)43例原發(fā)性肝細(xì)胞癌中HIF-1α、PTEN和P-gp的表達(dá)情況，探討HIF-1α、PTEN和P-gp與肝癌多藥耐藥的關(guān)系，并分析HIF-1α、PTEN和P-gp與肝癌臨床病理因素的關(guān)系。另取7例正常肝組織作為對(duì)照。 結(jié)果：在43例肝癌標(biāo)本中，HIF-1α、PTEN和P-gp蛋白陽(yáng)性表達(dá)分別為：60.5％(26/4

5、3)、46.5％(20/43)、51.2％(21/43)％。而7例正常的肝組織陽(yáng)性表達(dá)分別為：14.2％(1/7)、100％(7/7)、0％(0/7)。在肝癌組織中HIF-1α、PTEN和P-gp蛋白陽(yáng)性表達(dá)差異具有顯著性(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達(dá)與腫瘤的大小、分化程度有關(guān)，PTEN 蛋白表達(dá)與肝癌的分化程度、有無(wú)靜脈或膽道癌栓有關(guān)，P-gp蛋白表達(dá)腫瘤的大小、有無(wú)門靜脈、膽道癌栓有關(guān)。HIF-1α、PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)

6、相關(guān)性，PTEN和P-gp蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，HIF-1α、P-gp蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)性。 結(jié)論： (1)原發(fā)性肝癌組織存在著HIF-1α、P-gp蛋白的過(guò)表達(dá)以及PTEN的表達(dá)缺失； (2)HIF-1α的表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的分級(jí)、分期具有明顯的相關(guān)性；HIF-1α的過(guò)表達(dá)與抑癌基因PTEN的缺失呈負(fù)相關(guān)； (3)PI(3)k/PTEN/Akt/HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)上調(diào)P-gp的表達(dá)，導(dǎo)致

7、肝癌多藥耐藥的產(chǎn)生。 第二部分，目的：在細(xì)胞水平觀察缺氧的肝癌細(xì)胞株BEL-7402中HIF-1α和腫瘤多藥耐藥基因(Mufti-drug Resistance，mdrl)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上各組表達(dá)的變化，探討缺氧狀態(tài)下HIF-1α對(duì)肝癌細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。 方法：本部分采用CoCl<,2>建立缺氧誘導(dǎo)模型。 1、檢測(cè)肝癌細(xì)胞株BEL-7402分別在常氧和缺氧狀態(tài)下對(duì)阿霉素的IC<,50>；

8、 2、分為給藥組、缺氧+給藥組、和缺氧組，并另設(shè)正常對(duì)照組，分別培養(yǎng)24h、48h； 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞株BEL-7402分別在以上各組中的細(xì)胞凋亡率； 4、RT-PCR 檢測(cè)HIF-1α和MDR1的mRNA在肝細(xì)胞肝癌BEL-7402細(xì)胞中的表達(dá)水平。 5、Western-blo t檢測(cè)HIF-1α和MDR1的蛋白在肝細(xì)胞肝癌BEL-7402細(xì)胞中的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、肝癌細(xì)胞株

9、BEL-7402 分別在常氧和缺氧狀態(tài)下對(duì)阿霉素的IC<,50>分別為0.362±0.043 ug/ml、0.686±0.079 ug/ml，(P<0.05)。 2、RT-PCR證實(shí)缺氧6h后HIF-1amRNA是正常對(duì)照組的1.49倍(P>0.05)，缺氧12h后升高1.97倍，缺氧24h后HIF-1amRNA是正常對(duì)照組的2.94倍。缺氧48h后HIF-lamRNA是正常對(duì)照組的2.14倍。缺氧6h后MDR1mRNA是正常組

10、的1.64倍(P<0.05)；缺氧12h后MDR1mRNA是正常組的2.01倍，缺氧24h后MDR1mRNA是正常對(duì)照組的3.82倍。缺氧48h后MDR1mRNA是正常對(duì)照組的5.18倍(P<0.05)。 3、western Blot證實(shí)缺氧缺氧6h后HIF-1α蛋白是正常對(duì)照組的1.17倍，缺氧12h后HIF-1α蛋白是正常對(duì)照組的2.56倍，缺氧24h后HIF-1α蛋白是正常對(duì)照組的3.33倍。缺氧48h后HIF-1α蛋白是

11、正常對(duì)照組的5.33倍(P<0.05)。缺氧6h后P-gp蛋白是正常對(duì)照組的1.44倍，缺氧12h后P-gp蛋白是正常對(duì)照組的1.84倍，缺氧24h后P-gp 蛋白是正常對(duì)照組的5.96倍。缺氧48h后P-gp蛋白是正常對(duì)照組的6.84倍(P<0.05)。 結(jié)論： 1、用100μmol/L 的CoCL<,2>可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株BEL-7402發(fā)生缺氧，而且并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)； 2、缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株BEL

12、-7402對(duì)阿霉素的耐藥性增強(qiáng)； 3、任發(fā)生缺氧的肝癌細(xì)胞株BEL-7402中，HIF-1α具有調(diào)控MDR1表達(dá)的作用，HIF-1α對(duì)MDR1的調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的。 第三部分，目的：利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，研究表達(dá)HIF-1α的小發(fā)夾RNA(shRNA)載體對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402的影響。 方法：根據(jù)靶基因的不同區(qū)域設(shè)計(jì)兩組shRNA以及一個(gè)空白對(duì)照，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株BEL-7

13、402、孵育24h、48h后，RT-PCR 檢測(cè)肝癌細(xì)胞株BEL-7402 HIF-1α和MDR1mRNA的變化，Western blot檢測(cè)HIF-1α和P-gP蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1、RT-PCR 檢測(cè)缺氧狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞株BEL-7402瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA載體24h、48h后，HIF-1αmRNA分別為0.75±0.01、0.71±0.04、1.11±0.01：0.68±0.04、0.65±0.02、0.91±0

14、.02。MDR1mRNA 分別為0.68±0.04、0.65±0.02、0.91±0.02；0.75±0.01、0.71±0.04、1.11±0.01。 2、 Western Blot檢測(cè)缺氧狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞株BEL-7402瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA載體24h后，HIF-1α蛋白表達(dá)分別為0.53±0.02、0.51±0.03、0.65±0.03；而轉(zhuǎn)染48h后，HIF-1α蛋白表達(dá)比值分別為0.51±0.02、0.45±0.02、0

15、.72±0.03。肝癌細(xì)胞株BEL-7402瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA載體24h、48hh后，P-gP蛋白的表達(dá)分別為0.84±0.03、0.81±0.02、1.02±0.05：0.88±0.05、0.81±0.03、1.35±0.03。 結(jié)論： 1、成功篩選出兩條能特異而高效地抑制HIF-1α基因表達(dá)的shRNA，為進(jìn)一步研究該基因的功能和作用機(jī)制提供了新的手段； 2、缺氧狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞株BEL-7402瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HI

16、F-1α siRNA 載體后HIF-1α mRNA 表達(dá)被顯著抑制，同時(shí)也可以顯著抑制缺氧所導(dǎo)致的 MDR1mRNA.升高； 3、缺氧狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞株BEL-7402瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA 載體后 HIF-1α蛋白表達(dá)被顯著抑制，同時(shí)也可以逆轉(zhuǎn)缺氧所導(dǎo)致的P-gp蛋白升高； 4、本研究顯示，質(zhì)粒載體介導(dǎo)的siRNAs系統(tǒng)是一個(gè)有發(fā)展?jié)摿Φ南抡{(diào)靶基因表達(dá)的方法，可以在人細(xì)胞內(nèi)“敲除”HIF-1α基因，調(diào)節(jié)其下游