奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎新型疫苗的研制.pdf

1、奶牛乳房炎是世界范圍內(nèi)造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌，也是臨床上最難治療造成經(jīng)濟(jì)損失最大的致病菌。本文針對金黃色葡萄球菌有多糖莢膜，耐藥性強(qiáng)常規(guī)疫苗難免疫的特點(diǎn)，在對金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離鑒定篩選的基礎(chǔ)上，提取金黃色葡萄球菌的莢膜多糖，并將提取的莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合制成多糖偶合蛋白疫苗。據(jù)不同溶血型菌株提取其相應(yīng)外膜蛋白混合制成疫苗，結(jié)合篩選出的有效免疫佐劑和免疫途徑對新型疫苗的效果進(jìn)行評

2、估。本文共分四部分內(nèi)容。 試驗(yàn)一引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌地分離鑒定 我們調(diào)查濟(jì)南地區(qū)由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的流行情況，并對在濟(jì)南地區(qū)大奶牛場所采的150份乳房炎患牛乳樣進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，將分離的金黃色葡萄球菌按溶血型的不同分類并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為防治金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎地研究提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌為濟(jì)南地區(qū)引起奶牛乳房炎的主要病原菌。該菌對環(huán)丙沙星和利福霉素最為敏感。在引起

3、感染的金黃色葡萄球菌中以α溶血型最多，β溶血型次之，但不同溶血型的金黃色葡萄球菌引起的乳房炎危害程度不同，在臨床嚴(yán)重癥狀的金黃色葡萄球菌性乳房炎患牛乳汁中分離到金黃色葡萄球菌80％以上為β溶血型菌株。 試驗(yàn)二有效免疫佐劑和免疫途徑的篩選 為了提高疫苗的免疫效果，我們對疫苗的免疫佐劑和免疫途徑進(jìn)行了篩選與比較研究。臨床上用家兔和奶牛作為試驗(yàn)對象，分別以黃芪多糖提取物、白油一吐溫、氫氧化鋁作為佐劑與制備的金黃色葡萄球菌滅活苗

4、混合免疫家兔和奶牛。同時分別于后海穴、肌肉、皮下對家兔和奶牛免疫，觀察不同佐劑和免疫途徑對家兔、奶牛免疫功能的影響。比較家兔免疫前后血清抗體滴度變化以及攻毒后白細(xì)胞數(shù)目變化和淋巴細(xì)胞百分比變化。對奶牛免疫后測其血清抗體和乳汁中體細(xì)胞數(shù)變化。結(jié)果表明：黃芪多糖是一種有效的免疫佐劑；后海穴接種效果優(yōu)于常規(guī)部位免疫接種效果，是疫苗免疫較為理想的免疫部位。 試驗(yàn)三金黃色葡萄球菌莢膜多糖的制備及生物學(xué)特性鑒定 提取金黃色葡萄球菌的

5、莢膜多糖并檢測其理化特性及免疫原性，以便為新型亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。采用十六烷基三甲基溴化銨脫糖，冷酚萃取，不同濃度乙醇沉淀，高速離心等步驟精制金黃色葡萄球菌的莢膜多糖，用生物學(xué)、免疫學(xué)等方法分析鑒定。結(jié)果表明提取的莢膜多糖具有良好的多糖特性、結(jié)構(gòu)特征和免疫原性。用提取的莢膜多糖免疫BALB/C小鼠，并采用間接ELISA法測抗體水平，結(jié)果表明適當(dāng)劑量的莢膜多糖能夠刺激小鼠產(chǎn)生一定的抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗體。 試驗(yàn)四新型疫

6、苗的研制及效果評估 第一部分：金黃色葡萄球菌莢膜多糖—牛血清白蛋白偶合疫苗研究 用碳二亞胺將金黃色葡萄球菌莢膜多糖與牛血清白蛋白偶合，并用偶合物免疫小鼠，用ELISA法檢測小鼠血清中抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖的IgG抗體滴度，通過偶合物中多糖、蛋白含量的測定，顯示成功地合成了金黃色葡萄球菌莢膜多糖和牛血清白蛋白的偶合物，該偶合物有金黃色葡萄球菌莢膜多糖的血清學(xué)特異性。偶合苗免疫小鼠誘生的抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗體水平顯著

7、高于單獨(dú)用莢膜多糖或莢膜多糖與牛血清白蛋白簡單混合的免疫效果。用此偶合苗等比例加黃芪多糖佐劑免疫牛，定期測其血清中抗體水平和乳汁中體細(xì)胞水平，結(jié)果表明：該結(jié)合苗能使牛產(chǎn)生較高的抗體水平并能維持較低的體細(xì)胞水平，有較好的免疫保護(hù)作用。 第二部分：金黃色葡萄球菌莢膜多糖與鏈球菌G蛋白結(jié)合疫苗的研究 分別提取金黃色葡萄球菌的莢膜多糖和鏈球菌的G蛋白，通過碳二亞胺將二者偶合制成一種偶聯(lián)苗，希望獲得一種對金黃色葡萄球菌和鏈球菌皆有

8、預(yù)防效果的疫苗。用此偶合苗免疫小鼠，采血分離血清，通過ELISA檢測小鼠血清中抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗體水平及抗鏈球菌G蛋白抗體水平，并用豚鼠血清補(bǔ)體介導(dǎo)進(jìn)行體外殺菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示：該偶合疫苗免疫小鼠后小鼠血清中能同時檢測到抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖和鏈球菌G蛋白抗體，比單獨(dú)用多糖和蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗體效價水平高，而且產(chǎn)生的抗體有較強(qiáng)的體外殺菌活性。 第三部分：金黃色葡萄球菌外膜蛋白疫苗在鼠模型上的評估試驗(yàn) 分別提取四

9、種不同溶血型金黃色葡萄球菌的外膜蛋白，四種菌株分別為：JB9901，JB9801，JN001 和JN002，都是從臨床乳房炎患牛乳汁中分離得到，用該蛋白疫苗免疫小白鼠，測其產(chǎn)生的特異抗體水平高低，并在強(qiáng)毒攻擊后測其保護(hù)力。結(jié)果顯示：該蛋白疫苗能夠產(chǎn)生較廣譜的抗體應(yīng)答，免疫后小鼠能夠抵抗不同型金黃色葡萄球菌的攻擊。 以上研究結(jié)果表明：金黃色葡萄球菌多糖莢膜的存在是造成金黃色葡萄球菌性乳房炎難治療、難免疫的主要原因，我們提取