誘導(dǎo)腫瘤、病毒特異細(xì)胞免疫及tetramer技術(shù)檢測(cè)抗原特異CTL.pdf

1、癌癥免疫治療的主要目的是誘導(dǎo)有效的抗腫瘤特異細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)，而主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類分子在一系列惡性腫瘤中往往低表達(dá)，不足以在體內(nèi)引起有效的免疫應(yīng)答。人癌癥中的自身抗原是免疫系統(tǒng)識(shí)別的最普遍抗原，說明癌細(xì)胞源于宿主自身組織而非外源蛋白。識(shí)別自身抗原存在許多問題，如由于自身耐受難以引出抗腫瘤免疫。即使免疫系統(tǒng)能識(shí)別并與自身抗原反應(yīng)，通常免疫力也不足以排斥腫瘤。 FasL是腫瘤壞死因子(TNF)蛋白家族的一個(gè)

2、成員，組織學(xué)和流式細(xì)胞儀分析提示FasL表達(dá)細(xì)胞能引起局部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥，使腫瘤細(xì)胞受損，之后依賴CD8<'+>T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的清除。B16F10惡性黑色素瘤免疫原性極弱，因此是研究提高腫瘤免疫策略的良好模式。惡性黑色素瘤最具特色的抗原是非突變分化抗原，不僅表達(dá)于惡性黑色素瘤細(xì)胞，也表達(dá)于正常黑色素細(xì)胞，如糖蛋白100(gp100)，酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP)1和2、黑素A(Melan-A

3、)。從這些抗原中選擇3個(gè)有腫瘤排斥功能的抗原決定簇：TRP2、鼠糖蛋白100(mgp100)和它更具免疫源性的對(duì)應(yīng)物人gp100(hgp100)。此外，還選擇了2個(gè)在B16F10中表達(dá)的內(nèi)生性病毒抗原決定簇惡性黑色素瘤抗原肽(mdm)、逆病毒包膜蛋白(p15E)，合成抗原肽，制作Tetramer。 MHC-Ⅰ類分子-肽四聚體復(fù)合物技術(shù)是近年牛津大學(xué)同美國STAN-FORD大學(xué)共同研制發(fā)明的。它可以通過熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS

4、)在單細(xì)胞水平直接檢測(cè)抗原特異性CTL，并同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞定量。經(jīng)放射并表達(dá)FasL的B16F10細(xì)胞皮下注射使鼠產(chǎn)生免疫，3周后野生型B16F10激發(fā)，保護(hù)鼠行tetramer分析。牛痘病毒不僅誘導(dǎo)體液免疫，且強(qiáng)烈地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。因此，為了提高免疫應(yīng)答，部分保護(hù)鼠用含黑色素分化抗原的重組牛痘病毒(rVV)加強(qiáng)。體內(nèi)抗原特異殺傷還用另一種新技術(shù)來檢測(cè)。希望我們的觀察能幫助確定新的腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物，提供一種刺激產(chǎn)生廣譜抗腫瘤免疫的新途徑。

5、 實(shí)驗(yàn)方法： 本實(shí)驗(yàn)用B16F10惡性黑色素瘤C57BL/6鼠模型。使用2種技術(shù)來檢測(cè)免疫鼠中抗原特異CTL活性。 1)MHC Ⅰ類分子-肽-tetramer。選擇5種相關(guān)腫瘤抗原決定簇，合成抗原肽，其氨基酸序列如下：mdm(Kb)：YAMIYRNL，p15E(Kb)：KSPWFTTL，trp-2(v)(K<'b>)：VYDFFVWL，trp-2(s)(K<'b>)：SVYDFFVWL hgp100(D<'b>)：

6、KVPKNQDWL，mgp100(D<'b>)：EGSRNQDWL，制作相應(yīng)tetramer：BirA生物素酶識(shí)別位點(diǎn)的MHC-H-2K<'b>或H-2D<'b>的胞外區(qū)、β2m的cDNA被克隆進(jìn)入表達(dá)質(zhì)粒，蛋白以包涵體形式在大腸桿菌(E．coli)中表達(dá)。重鏈、β2m和合成抗原肽在4℃含蛋白酶抑制劑．的緩沖液中折疊，形成穩(wěn)定的三分子復(fù)合物。濃縮后，復(fù)合物酶標(biāo)生物素?；?，由快速蛋白液相色譜(FPLC)按照分子量大小純化。生物素酰基化蛋

7、白單體與結(jié)合熒光素的細(xì)菌蛋白以4：1摩爾比率混合。 2)體內(nèi)殺傷分析。CFSE是一種分子探針染料，在488nm可激發(fā)綠色熒光，因此可通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。樹突狀細(xì)胞(DC)如與熒光染料結(jié)合，可在引流淋巴結(jié)中被檢出。DC與MHC-Ⅰ類分子抗原肽結(jié)合，可作為CTL的靶，如存在抗原特異CTL，結(jié)合抗原DC的特異殺傷就能在不同小鼠中被檢測(cè)出來。結(jié)合CFSE的同源靶細(xì)胞(脾)加入相關(guān)抗原肽，尾靜脈注入保護(hù)鼠，5～18小時(shí)采集鼠血或鼠脾，F(xiàn)A

8、CS分析。標(biāo)記相關(guān)抗原肽的靶細(xì)胞由于被特異CTLs識(shí)別和殺傷，應(yīng)該減少或消失。 將實(shí)驗(yàn)與對(duì)照鼠分成4組，施以不同處理因素：FasL，rVV(mgp100，NP)，F(xiàn)asL+rVV組，對(duì)照組，用以初次免疫激活。用自然鼠脾細(xì)胞與抗原肽(hgp100，Np)加強(qiáng)一次，行tetramer檢測(cè)及體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)。體外培養(yǎng)各組脾細(xì)胞建立CTL細(xì)胞系，共分兩組，1組用hgp100刺激，末次刺激后一周用hgp100，mgp100兩種tetramer

9、檢測(cè)，另1組分別用6種抗原肽刺激，末次刺激后行tetramer交叉檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 我們建立起一種tetramer與碘化丙啶(PI)相結(jié)合的技術(shù)。排除PI陽性細(xì)胞，有助于減少死細(xì)胞非特異染色，提高染色質(zhì)量。重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，除一只rVVNP處理鼠作為陽性對(duì)照，脾臟中檢出抗原特異CTL，其他各組血液、淋巴結(jié)、脾tetramer檢測(cè)均陰性。我們共進(jìn)行了5次殺傷實(shí)驗(yàn)，均難以解釋。由于沒能從鼠中得到足夠細(xì)胞，標(biāo)記CFSE、結(jié)合抗原

10、肽的對(duì)照峰和相關(guān)峰都較低。血液標(biāo)本出現(xiàn)雙峰，脾臟檢測(cè)出現(xiàn)單峰。與其他組相比，F(xiàn)asL+rVVgp100組，峰高明顯降低，但無抗原特異性，因?yàn)閷?duì)照峰與相關(guān)峰均降低。體外細(xì)胞培養(yǎng)，第1組中rVV處理細(xì)胞、FasL+rVVgp100處理細(xì)胞，tetramer檢測(cè)，出現(xiàn)抗原特異CTL，hgp100、mgp100 tetramer檢測(cè)均陽性，其它組陰性。第2組中FasL+rVVgp100處理細(xì)胞，出現(xiàn)tetramer交叉檢測(cè)陽性，其它處理因素脾細(xì)

11、胞檢測(cè)陰性，提示在一些標(biāo)本中存在非特異背景染色。 結(jié)論： 1．tetramer技術(shù)能精確檢測(cè)腫瘤抗原特異CTL。 2．FasL與rVVgp100兩種處理因素聯(lián)合能打破惡性黑色素瘤B16F10的自身耐受狀態(tài)，產(chǎn)生抗原特異性CTL。 3．FasL與rVVgp100兩種處理因素聯(lián)合，可能誘導(dǎo)固有免疫，產(chǎn)生非特異性殺傷。 4．FasL與rvVgp100兩種處理因素聯(lián)合，能擴(kuò)大免疫效應(yīng)，產(chǎn)生抗原交叉反應(yīng)。