肝細(xì)胞癌患者外周血及癌組織中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞增多的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制作用的淋巴細(xì)胞亞群，占正常人外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的5-10％。Treg細(xì)胞最早由日本科學(xué)家Sakaguchi于1995年首先報(bào)道，并且迅速成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Treg細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物為CD4、CD25，而胞核標(biāo)志物為Foxp3。Foxp3對(duì)于Treg細(xì)胞的分化、發(fā)育以及發(fā)揮免疫抑制功能具有重要作用。自Treg細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)之后多種自身免疫系

2、統(tǒng)疾病如類風(fēng)關(guān)（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)等都被認(rèn)為與該群細(xì)胞功能受損或者數(shù)量減少有關(guān)。而正是由于Treg細(xì)胞所特有的負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用也吸引了越來越多研究者的目光。近年來的研究表明腫瘤組織當(dāng)中Treg細(xì)胞含量的高低與腫瘤患者的愈后密切相關(guān)，特別是在肝細(xì)胞癌(hepatocell

3、ular carcinoma, HCC)患者當(dāng)中Treg細(xì)胞含量越高者其愈后往往越差。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及一些Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)表明特異性的清除Treg細(xì)胞可以明顯抑制腫瘤生長甚至是使腫瘤完全消退。這表明Treg細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫抑制作用有可能是導(dǎo)致癌細(xì)胞成功逃避機(jī)體免疫監(jiān)視進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因之一。因此本研究的目的在于明確HCC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的分子機(jī)制并進(jìn)一步探討其在HCC治療過程當(dāng)中的潛在價(jià)值。本論文分成三部分加以討論。
　　第

4、一部分肝細(xì)胞癌患者外周血及癌組織中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的含量與預(yù)后的關(guān)系
　　我們首先使用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)HCC患者外周血中CD4+Foxp3+ Treg細(xì)胞含量進(jìn)行檢測，并同慢性乙肝后肝硬化患者及正常人外周血中的Treg細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。通過對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)HCC患者及慢性乙肝后肝硬化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞含量較正常人均明顯增加，但HCC患者與慢性乙肝后肝硬化患者外周血中Treg細(xì)胞含量并無明顯差異。

5、接下來我們使用免疫組化技術(shù)對(duì)151例HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行染色，通過免疫組化我們發(fā)現(xiàn)絕大部分Foxp3+細(xì)胞位于癌組織邊緣，僅有少部分陽性細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于癌旁及癌組織中心部位。根據(jù)癌組織當(dāng)中陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)由低到高將151例手術(shù)患者進(jìn)行排列，取中位數(shù)將該隊(duì)列分為低表達(dá)組（75例）和高表達(dá)組（76例）。隨后使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型對(duì)HCC患者術(shù)后總生存期(overall survival，OS)和無瘤生存期(disease free survi

6、val，DFS)相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素和多因素方差分析。結(jié)果顯示，除腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜等因素與患者的生存和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)外，癌組織中Foxp3+細(xì)胞數(shù)目也是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這一部分研究提示，癌組織中Treg細(xì)胞數(shù)目的多少是預(yù)測HCC患者預(yù)后的重要標(biāo)志物。因此明確HCC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的相關(guān)分子機(jī)制有可能為HCC的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。
　　第二部分肝癌細(xì)胞分泌TGF-β1誘導(dǎo)外周血及癌組織中CD4+CD25-

7、T淋巴細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)機(jī)制研究
　　在前一部分中我們發(fā)現(xiàn)HCC和Treg細(xì)胞關(guān)系密切，并且高表達(dá)Treg細(xì)胞的HCC患者其預(yù)后較差，在本節(jié)中我們主要探討肝細(xì)胞癌如何誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生。前人的研究表明TGF-β1是誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞因子，通過免疫熒光和免疫組化我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞具有分泌TGF-β1的功能，這表明腫瘤有可能通過分泌TGF-β1來誘導(dǎo)外周血及癌組織中的幼稚CD4+T細(xì)胞向T

8、reg細(xì)胞轉(zhuǎn)化。接下來我們使用磁珠將小鼠脾臟和淋巴結(jié)中的CD4+CD25-細(xì)胞分離并使用小鼠肝細(xì)胞癌Hepa1-6培養(yǎng)上清在抗CD3/CD28 beads的刺激下體外培養(yǎng)3天后通過流式細(xì)胞儀、Western blot和real-time PCR來檢測其中Foxp3表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在加入HCC細(xì)胞培養(yǎng)上清液后4.66％的CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3而對(duì)照組只有1.69％細(xì)胞表達(dá)。為證明HCC細(xì)胞分泌的TGF-β1是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生的主要

9、因子，我們首先使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了TGF-β1 knockdownHepa1-6(shRNA-TGF-β1-Hepa1-6)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞并收集上清液，同時(shí)使用TGF-βreceptorⅠ磷酸化酶抑制劑及recombinant TGF-β1分別培養(yǎng)磁珠分選的CD4+CD25-T細(xì)胞。結(jié)果表明在使用了shRNA-TGF-β1-Hepa1-6細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑后腫瘤上清誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向

10、Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能受到顯著抑制，而在TGF-β1 knockdown細(xì)胞的培養(yǎng)上清液加入重組的TGF-β1則可以顯著的增加CD4+CD25-細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。我們還同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)作用具有時(shí)間依賴性，其在3天時(shí)誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞比例最高。上述結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1是誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞因子。接下來我們將Hepa1-6，scramble和shRNA-T

11、GF-β1-Hepa1-6細(xì)胞分別接種于小鼠肩胛部位，2周后處死小鼠并取出腫瘤制成蠟塊，切片后免疫組化檢測其中Foxp3+細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)在shRNA-TGF-β1-Hepa1-6組腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少。我們同時(shí)使用上述三株細(xì)胞進(jìn)行小鼠尾靜脈注射4周后處死小鼠檢測其脾臟中Treg細(xì)胞數(shù)目，與上述結(jié)果類似shRNA-TGF-β1-Hepa1-6組小鼠脾臟中的Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少。在本節(jié)中我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)詳細(xì)闡述了肝細(xì)胞癌通過分

12、泌TGF-β1誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制，為破解HCC如何逃避機(jī)體免疫監(jiān)控提供了詳實(shí)的證據(jù)。
　　第三部分肝細(xì)胞癌分泌的TGF-β1對(duì)淋巴細(xì)胞功能和癌細(xì)胞自身增殖能力的影響及相關(guān)機(jī)制的探討
　　和對(duì)照組相比recombinant TGF-β1和Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠顯著抑制CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ并且能夠抑制DCs細(xì)胞成熟，而在kncokdown TGF-β1后上述抑制效應(yīng)明顯減弱。

13、通過構(gòu)建shRNA-TGF-β1-Hepa1-6細(xì)胞株我們發(fā)現(xiàn)在knockdown TGF-β1基因后Hepa1-6細(xì)胞增殖速度明顯減慢，這表明HCC細(xì)胞分泌的TGF-β1不僅對(duì)癌組織中的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響，同時(shí)還會(huì)對(duì)癌細(xì)胞自身的增殖發(fā)揮作用。為了探討HCC細(xì)胞分泌的TGF-β1對(duì)癌細(xì)胞自身的影響，我們首先進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在使用TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑以后肝癌細(xì)胞形成克隆的能力明顯增強(qiáng)，這表HCC細(xì)胞分泌的T

14、GF-β1對(duì)自身的增殖具有抑制作用，而在knockdown TGF-β1后Hepa1-6細(xì)胞形成克隆的能力顯著下降，這表明TGF-β1不但具有抑制細(xì)胞增殖的作用，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過流式檢測我們發(fā)現(xiàn)在阻斷TGF-β receptorⅠ介導(dǎo)的下游信號(hào)通路以后G1期細(xì)胞減少而S期細(xì)胞增多，而在knockdown TGF-β1后G1期細(xì)胞增多S期細(xì)胞減少，并且knockdown TGF-β1引起Hepa1-6細(xì)胞早期凋亡增加。這表明TGF

15、-β1有可能通過控制細(xì)胞周期來達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖的目的。接下來我們利用Western blot檢測了與細(xì)胞周期相關(guān)的一些蛋白如c-myc、cyclin D3、CDK4等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑后除CDK4外上述調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白顯著增加，而敲除TGF-β1基因后其含量則明顯下降，這表明肝癌細(xì)胞可以通過分泌TGF-β1調(diào)節(jié)其自身的增殖速度。接著通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在knockdown TGF-β1后H

16、epa1-6的成瘤能力明顯減弱，小鼠的生存時(shí)間顯著延長。上述實(shí)驗(yàn)表明肝癌細(xì)胞分泌的TGF-β1不僅抑制淋巴細(xì)胞的功能對(duì)HCC細(xì)胞本身具有雙重作用，抑制TGF-β1的分泌有可能為肝癌治療提供新的靶點(diǎn)。
　　綜上所述，肝細(xì)胞癌能夠通過分泌TGF-β1誘導(dǎo)CD4+CD25-淋巴細(xì)胞向具有負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)換，而Treg細(xì)胞反應(yīng)了患者體內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)，癌組織內(nèi)過高的Treg細(xì)胞是患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另一方面，HCC細(xì)