苯妥英鈉和奧拉西坦對(duì)昆明小鼠海馬、小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.pdf

1、目的:苯妥英鈉(Phenytoinsodium，PHT)在臨床用于治療癲癇、心律失常、三叉神經(jīng)痛等疾病，其中以抗癲癇應(yīng)用最為常見(jiàn)。但其用藥劑量和中毒劑量非常接近，且體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)模型呈非線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，易出現(xiàn)多個(gè)系統(tǒng)的毒副作用。神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)主要為小腦萎縮、小腦功能失調(diào)癥、智能障礙、顱內(nèi)壓增高等。奧拉西坦(Oiracetam，ORC)是目前臨床廣泛應(yīng)用的促智藥物之一，可影響膽堿能、谷氨酸能等多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)及提高大腦對(duì)氧的利用能力，

2、促進(jìn)大腦聯(lián)絡(luò)纖維突觸的可塑性，調(diào)動(dòng)未受損腦組織重組及功能重建，具有激活、保護(hù)和修復(fù)腦細(xì)胞的作用。在臨床上用于治療各種理化因素引起的腦損傷，腦缺氧和慢性腦功能不全等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)水平和原位脫氧核糖核苷酸末端標(biāo)記法(TUNEL)，觀察苯妥英鈉和奧拉西坦對(duì)小鼠海馬、小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討苯妥英鈉引起神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)機(jī)制，奧拉西坦對(duì)苯妥英鈉作用后神經(jīng)細(xì)胞是否有保護(hù)作用及其劑量與效果之間的

3、關(guān)系。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:4周齡健康雄性昆明小鼠40只，體重22±2g，隨機(jī)平均分為NS組（8只）;PTH組（8只）;PTH與低、中、高劑量ORC聯(lián)合組:PTH+ORC1組（8只）、PTH+ORC2組（8只）、PTH+ORC3(8只)。
　　2、藥物干預(yù):各組PTH均為100mg/kg/d，ORC低、中、高劑量分別為100mg/kg/d、300mg/kg/d、900mg/kg/d;NS組給以等劑量的生

4、理鹽水。以上均為灌胃給藥，每天1次。
　　3、標(biāo)本的制作及檢測(cè):用10％水合氯醛麻醉小鼠，仰臥固定，剪開(kāi)胸腔，從心尖處插入圓頭針，先灌流0.9％生理鹽水沖洗，再灌注4％多聚甲醛磷酸緩沖液，同時(shí)從右心耳處剪開(kāi)心臟放血。灌注完畢后立即斷頭，迅速取出大腦和小腦，放入4％多聚甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋，選取小腦和海馬連續(xù)冠狀切片，片厚5μm。HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，免疫組織化學(xué)

5、法分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間均數(shù)顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用方差分析One-WayANOVA，組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、HE染色結(jié)果
　　NS組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞均排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，胞漿紅染胞核藍(lán)染，偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。PHT組和PHT+ORC1組的海馬、小腦均可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，

6、細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮深染及周?chē)张菪纬?。PHT+ORC3組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞均排列基本整齊，細(xì)胞凋亡程度較輕。PHT+ORC2組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況均介于PHT+ORC1組與PHT+ORC3組之間。
　　2、TUNEL檢測(cè)結(jié)果:
　　NS組海馬和小腦均可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。PHT組和PHT+ORC1組的海馬和小腦均可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞。PHT+ORC3組海馬和小腦凋亡細(xì)胞均稀疏分布。PHT+ORC2組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情

7、況均介于PHT+ORC1組和PHT+ORC3組之間。對(duì)各組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出:與NS組相比，PHT組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT組與PHT+ORC1組兩組間的海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率差異均無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與PHT組相比，PHT+ORC2組海馬和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與PHT組相比，PHT+ORC3組海馬和小腦神

8、經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT+ORC所有組中海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT+ORC所有組中小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、Bcl-2表達(dá)結(jié)果:
　　NS組海馬和小腦均可見(jiàn)大量Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，染色較深。PHT組和PHT+ORC1組的海馬和小腦均可見(jiàn)少量Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)

9、性細(xì)胞散在分布且染色淺淡。PHT+ORC3組海馬和小腦陽(yáng)性細(xì)胞均分布尚密集。PHT+ORC2組海馬和小腦陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況均介于PHT+ORC1組和PHT+ORC3組之間。對(duì)各組海馬和小腦Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞AO值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出:與NS組相比，PHT組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;PHT組與PHT+ORC1組兩組間的海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞差異均無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與PHT組相比，PHT+O

10、RC2組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與PHT組相比，PHT+ORC3組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;PHT+ORC所有組中海馬表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT+ORC所有組中小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、Bax表達(dá)結(jié)果:
　　NS組海馬和小腦均可見(jiàn)少量Bax表達(dá)陽(yáng)性細(xì)

11、胞，陽(yáng)性細(xì)胞散在分布且染色淺淡。PHT組和PHT+ORC1組的海馬和小腦均可見(jiàn)大量表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，染色較深。PHT+ORC3組海馬和小腦陽(yáng)性細(xì)胞均分布稀疏。PHT+ORC2組海馬和小腦陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況均介于PHT+ORC1組和PHT+ORC3組之間。對(duì)各組海馬和小腦Bax表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞AO值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出:與NS組相比，PHT組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT組與PHT+ORC1組兩組間

12、的海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞差異均無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與PHT組相比，PHT+ORC2組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與PHT組相比，PHT+ORC3組海馬和小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;PHT+ORC所有組中海馬表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PHT+ORC所有組中小腦表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞每?jī)山M之間相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

13、。
　　結(jié)論:
　　1、治療劑量PHT可引起成年小鼠海馬、小腦神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增多。
　　2、PHT和ORC聯(lián)合應(yīng)用，常規(guī)口服劑量ORC可降低PHT導(dǎo)致的小鼠海馬、小腦神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2的低表達(dá)及Bax的高表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系，劑量越高其抑制細(xì)胞凋亡作用越明顯。
　　3、促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡是PHT造成神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的可能機(jī)制之一，ORC神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)