急性髓性白血病FLT3表達與FLT3-ITD及其臨床意義.pdf

1、浙江大學碩士學位論文急性髓性白血病FLT3表達與FLT3ITD及其臨床意義姓名：劉旭輝申請學位級別：碩士專業(yè)：內科學（血液?。┲笇Ы處煟航饾?0061220發(fā)AML患者80例，其中M0型8例，M1型8例，M2型25例，M3型20例，M4型6例，M5型13例。部分緩解期患者13例，完全緩解期患者36例。10例正常入骨髓作為對照。2方法：(1)實時熒光定量PCR方法檢測FLT3mRNA表達水平：Trizol一步法抽提骨髓單個核細胞總RNA，

2、逆轉錄反應制備cDNA，F(xiàn)LT3及pactin的引物及探針設計參考文獻，常規(guī)PCR擴增6例FLT3陽性初治AML患者的逆轉錄產(chǎn)物，構建擴增產(chǎn)物的重組質粒，提取質粒，制備陽性標準品，應用德國羅氏公司的LightCycler熒光定量PCR儀，日本Takara公司的PremixExTaqTM定iPCR試劑盒擴增，將重組質粒系列十倍比稀釋后建立標準曲線，應用已建立的實時熒光定量PCR方法，患者cDNA與標準品同時行定量PCR，每次實驗均設立pa

3、cti內對照，F(xiàn)LT3與pactin轉錄產(chǎn)物的絕對拷貝數(shù)之比，作為FLT3mRNA表達水平，用于分析。(2)RTPCR方法檢測FLT3flTD突變：Trizol一步法抽提骨髓單個核細胞總RNA，逆轉錄反應制備cDNA，應用美國MJ公司的PTC200型常規(guī)PCR儀進行擴增，209／L瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物電泳條帶在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。(3)基因組PCR方法檢測FLT3／ITD突變：Gentra提取DNA試劑盒制備基因組DNA

4、，應用PTC200型常規(guī)PCR儀進行擴增，209／L瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物電泳條帶在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。(4)細胞免疫表型檢測：采用活細胞直接免疫熒光法標記，流式細胞儀檢測初發(fā)AML患者白血病細胞免疫表型，髓系抗原采用CDl3、CD33、CDl4、HLADR、MPO，干，祖細胞標志采用CD34。(5)染色體核型分析：采用R顯帶法，核型異常的描述按照國際人類細胞遺傳學命名體$|I[ISCN(1995)]。根據(jù)預后的好、中、差