AJAP1在腦膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)及抑制細(xì)胞增殖與侵襲的分子機(jī)制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,其中2/3以上為惡性膠質(zhì)瘤,占成人全身腫瘤約2％,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中位生存期僅1年,5年的生存期幾乎為零。手術(shù)切除,術(shù)后化療和放療綜合療效仍不是很理想,目前尚無根治方法。腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長的特性是膠質(zhì)瘤難以根治和復(fù)發(fā)的根本原因。因此膠質(zhì)瘤治療策略的優(yōu)化不僅應(yīng)著眼在原發(fā)部位腫瘤的治療,還應(yīng)著力控制腫瘤細(xì)胞向正常腦組織的侵襲和轉(zhuǎn)移。尋找具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移特性的相關(guān)基因,深入揭示其作用機(jī)制,對膠質(zhì)瘤治療

2、具有重要意義。
　　越來越多的證據(jù)表明在人類染色體1p36區(qū)域編碼著許多類似腫瘤抑制基因。最近研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)粘附連接相關(guān)蛋白-1(Adherens Junctional Associated Protein-1,AJAP1,也稱為 Shrew-1)作為另一個(gè)類似抑癌基因定位于人類染色體1p36區(qū)域。Radlwimmer研究組對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行基因組雜交和微陣列分析比較, AJAP1首先被描述為一種與膠質(zhì)母細(xì)胞發(fā)生的生物標(biāo)記物。隨

3、后,Zhang課題組證實(shí)在SVHVC, LOVO, SW480,MCF-7等多種細(xì)胞系中,AJAP1啟動(dòng)子區(qū)存在著高度甲基化。但是,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中改變 AJAP1的表達(dá)水平影響細(xì)胞侵襲和增殖的機(jī)制仍然不清楚。
　　本課題重點(diǎn)研究AJAP1在膠質(zhì)瘤中的異常表達(dá)情況,探討其與膠質(zhì)瘤級別之間的關(guān)系,應(yīng)用AJAP1重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AJAP1的表達(dá)水平,初步探討研究AJAP1對膠質(zhì)瘤生物學(xué)表型的影響及其潛在機(jī)制。
　

4、　方法：
　　第一部分應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色以及免疫熒光共聚焦成像方法檢測48例膠質(zhì)瘤標(biāo)本、5例正常腦組織標(biāo)本中AJAP1的表達(dá)水平,采用Western blot方法對8個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、1個(gè)正常細(xì)胞系HEK293中AJAP1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,初步研究分析AJAP1與膠質(zhì)瘤級別之間的關(guān)系。
　　第二部分側(cè)重于研究人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染AJAP1重組腺病毒后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)表型及對細(xì)胞骨架影響的體外研究,并初步探討其潛在機(jī)制

5、。U87、U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染AJAP1重組腺病毒質(zhì)粒后,Transewell實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的改變;平板克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力;劃痕實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞遷移能力。Western blot方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲等相關(guān)指標(biāo)的變化,同時(shí)應(yīng)用免疫熒光方法檢測過表達(dá)AJAP1后對細(xì)胞骨架的變化。
　　第三部分則利用顱腦立體定向技術(shù)將同時(shí)轉(zhuǎn)染AJAP1重組腺病毒和熒光素酶慢病毒的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種在5周大小的BALB/c-nu

6、(SPF)雌性裸鼠尾狀核建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型,設(shè)空白對照組,利用活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)( IVIS Lumina Imaging System)動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長情況及裸鼠的生存期的改變,應(yīng)用組織病理學(xué)方法檢測兩組動(dòng)物腫瘤標(biāo)本中增殖、侵襲等蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　通過免疫組化對石蠟切片檢測顯示:膠質(zhì)瘤樣本中AJAP1的表達(dá)水平顯著低于正常腦組織,并且隨著膠質(zhì)瘤級別的增高,AJAP1的表達(dá)隨著降低。組織免疫熒光試驗(yàn)也同

7、樣證實(shí)在高級別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,AJAP1的表達(dá)明顯低于低級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本,與免疫組化結(jié)果相符,AJAP1定位于胞漿。因此AJAP1的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級呈負(fù)相關(guān)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,Western blot檢測顯示在人胚腎上皮細(xì)胞 HEK293中呈高表達(dá),而在大部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中顯著低表達(dá),以A172、TJ905、TJ899低表達(dá)最為顯著。隨后,利用AJAP1重組腺病毒轉(zhuǎn)染U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,通過提高細(xì)胞中AJAP1的蛋白表達(dá)水

8、平,AJAP1組與空白對照組及轉(zhuǎn)染空載體 vector組相比較,平板克隆形成試驗(yàn)顯示 AJAP1組腫瘤細(xì)胞的克隆數(shù)形成減低,transwell試驗(yàn)顯示AJAP1組細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制,劃痕試驗(yàn)顯示細(xì)胞的遷移能力下降,Western Blot檢測Ki-67、MMP-9蛋白的表達(dá)水平均有明顯的下調(diào)。在細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)中,過表達(dá)AJAP1后, U87、U251細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,AJAP1組與vector組相比較,細(xì)胞生長模式發(fā)生改變

9、,由原來的球狀聚集生長形態(tài)變?yōu)槠瑺钌L,絲狀偽足明顯減少。
　　在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,活體動(dòng)物生物熒光成像結(jié)果證實(shí)U87-AJAP1組成瘤明顯小于U87-vector組,且vector組于32d內(nèi)全部死亡,AJAP1組32d內(nèi)僅死亡4只。免疫組化結(jié)果表明AJAP1的表達(dá)明顯上調(diào),而Ki-67、MMP-9的表達(dá)明顯下調(diào),與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
　　結(jié)論：
　　1.以正常腦組織做對照,AJAP1基因在膠質(zhì)瘤標(biāo)本和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

10、中存在低表達(dá),與腫瘤級別呈負(fù)相關(guān),提示AJAP1可能作為抑癌基因參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.應(yīng)用AJAP1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞后,可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,細(xì)胞免疫熒光提示在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)AJAP1后,可能通過對細(xì)胞骨架的重建、絲狀偽足的減少,從而降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力。
　　3.成功建立U87細(xì)胞顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型,在體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)了AJAP1的抑瘤作用,與體外實(shí)