OX40L在實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血再灌注模型腦組織中的表達(dá)及其意義的研究.pdf

1、目的:缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)再灌注損傷(reperfusion injury)的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜,如興奮性氨基酸毒性作用、炎癥、細(xì)胞凋亡等,其中免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的壞死及缺血區(qū)域的炎癥性損傷成為熱點(diǎn),然而,抗炎治療在腦梗死的臨床研究中仍未取得理想效果。因此,尋找新的炎癥因素并加以抑制可能為缺血性腦血管病的治療帶來(lái)新的突破。截至目前,我們實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)對(duì)諸如血小板再生生長(zhǎng)因-

2、BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、水孔蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growthfactor,IGF-1)、IL-6、TNF-α、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、補(bǔ)體受體2、補(bǔ)體C3、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等因子在大鼠大腦缺血組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)

3、行了系列研究,發(fā)現(xiàn)以上因子均積極參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程[1-6],同時(shí)對(duì)腦心通、姜黃素、丹參酮、氧化苦參堿等中藥試劑加以篩選,試圖尋找有效抑制炎癥反應(yīng)的藥物,觀察到一定效果,但是炎癥因子數(shù)量諸多,相互之間作用復(fù)雜,以及許多病理生理機(jī)制仍未闡明,故仍需進(jìn)一步深入研究,諸多研究?jī)?nèi)容已于國(guó)內(nèi)外期刊發(fā)表[7]。本次實(shí)驗(yàn)為系列研究之一。OK40L是共刺激分子的一員。該分子系腫瘤壞死因子超家族的新成員,是OX40的天然配體,表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞

4、、B細(xì)胞、T細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞以及某些組織器官包括心、骨骼肌、睪丸和肺,有較廣泛的生物學(xué)活性,包括促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的分化成熟,增強(qiáng)T細(xì)胞功能,促進(jìn)細(xì)胞的粘附作用,參與炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫等。最新研究主要集中于動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征等,因此,研究缺血再灌注模型腦組織OX40L的表達(dá)或許可以進(jìn)一步闡明缺血再灌注的損傷機(jī)制,并為臨床缺血性腦血管病再灌注損傷提出可能的治療位點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)參照Koizumi線(xiàn)栓法并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)建

5、立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(middle cerebral artery reperfusion,MCAR)模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和western blot測(cè)定缺血再灌注后大鼠大腦組織OX40L的動(dòng)態(tài)表達(dá)及缺血再灌注后腦梗死體積的變化,旨在探討缺血再灌注模型大鼠大腦組織OX40L的表達(dá)和其意義。
　　 方法:
　　 1模型的制備本實(shí)驗(yàn)參照Koizumi[8]線(xiàn)栓法建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(middle cerebral

6、artery reperfusion,MCAR)模型。我們實(shí)驗(yàn)室依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)認(rèn)為,本模型優(yōu)點(diǎn)在于[9]:①無(wú)需開(kāi)顱,屬相對(duì)非侵入的方法②可實(shí)現(xiàn)缺血后再灌注。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)具有一定的缺點(diǎn)[9]:①動(dòng)物體質(zhì)量要求嚴(yán)格,一般250-300 g;②插入線(xiàn)拴可能影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的血液循環(huán),造成缺血后體溫升高,影響缺血結(jié)果:⑧需要一定的手術(shù)技巧;④模型實(shí)質(zhì)是栓塞性卒中,與人群常見(jiàn)卒中存在差異。因此,我們實(shí)驗(yàn)室在參照Koizumi方法的

7、基礎(chǔ)上,密切觀察并控制以下方面:①保持室溫在26℃,室溫過(guò)低使大鼠難于蘇醒,甚至迅速死亡;②插線(xiàn)應(yīng)緩慢分多次拔出,否則,再灌注血流過(guò)大,引起動(dòng)物缺血區(qū)出血等損傷,使動(dòng)物死亡率升高;③分離血管要徹底,勿把與頸外動(dòng)脈(externalcarotid artery,ECA)并行的神經(jīng)結(jié)扎,減少對(duì)頸動(dòng)脈分叉下的交感神經(jīng)節(jié)損傷,胸骨甲狀肌和胸骨舌骨肌覆蓋的氣管的過(guò)度刺激,導(dǎo)致大鼠術(shù)中死亡;④插入線(xiàn)拴速度盡可能快,避免時(shí)間長(zhǎng)了血管內(nèi)血栓形成;⑤術(shù)后

8、補(bǔ)足手術(shù)丟失的體液;⑥保證動(dòng)物營(yíng)養(yǎng),尤其術(shù)后,將飼料磨制成粉狀物以置于飼養(yǎng)籠內(nèi);⑦避免過(guò)度刺激大鼠,減少其應(yīng)激狀態(tài);⑧避免動(dòng)物麻醉的二次注射和影響模型的評(píng)分及減少其腦保護(hù)作用;⑨模型評(píng)分最好于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蘇醒后半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。
　　 2采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機(jī)分為2組:假手術(shù)(sham)組、MCAR組。根據(jù)時(shí)間點(diǎn)分為6 h、24 h、48 h、72 h、96 h五個(gè)亞組。應(yīng)用Koizumi等的線(xiàn)栓法建立大

9、鼠MCAR模型,并至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。假手術(shù)組除不插線(xiàn)栓外其余操作同MCAR組。
　　 3應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)腦組織免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),TTC染色測(cè)定腦梗死體積,western blot測(cè)定OX40L的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1腦梗死體積測(cè)定:
　　 TTC染色顯示:sham組腦組織均勻紅染無(wú)梗死灶,MCAR組可見(jiàn)大面積白色梗死灶,多位于右側(cè)基底節(jié)、頂區(qū)和顳區(qū)皮質(zhì)。腦梗死體積測(cè)定顯示:MCA

10、R組與sham組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)要求;
　　 2腦組織免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):
　　 腦組織免疫陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果顯示:MCAR組各亞組6 h、24 h、48 h、72h、96 h OX40L未見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫陽(yáng)性者。
　　 3.腦組織western blot測(cè)定OX40L:
　　 結(jié)果顯示各組經(jīng)western blot測(cè)定未見(jiàn)OX40L表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 動(dòng)物模型