RASSF1A基因在骨肉瘤中抑癌機(jī)制研究及其與Wnt信號(hào)通路關(guān)系.pdf

1、目的:骨肉瘤是由具有成骨潛能的骨間葉組織發(fā)展而來的惡性結(jié)締組織瘤，也是原發(fā)性惡性骨腫瘤之中發(fā)病率最高腫瘤之一。骨肉瘤有高度軟組織侵襲性以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向，在臨床表現(xiàn)出高度惡性。RASSF1A是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞中由于其啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化導(dǎo)致表達(dá)缺失，但其對(duì)于骨肉瘤的抑癌作用及抑癌作用機(jī)制尚未闡明。本研究探討RASSF1A基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的影響，并在此基礎(chǔ)上研究RASSF1A基因?qū)侨?/p>

2、瘤增殖遷移相關(guān)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用，希望通過上述工作促進(jìn)骨肉瘤靶向治療的開展。
　　方法:本項(xiàng)目構(gòu)建抑癌基因RASSF1A重組腺病毒并感染骨肉瘤細(xì)胞，在細(xì)胞水平探討RASSF1A基因與骨肉瘤的關(guān)系。首先利用免疫印跡法(Western Blot)檢測幾種骨肉瘤細(xì)胞系中RASSF1A蛋白的表達(dá)情況;在沒有RASSF1A基因表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系MNNG/HOSC1中，利用腺病毒載體過表達(dá)RASSF1A，檢測RASSF1

3、A基因過表達(dá)對(duì)骨肉瘤增殖(MTT實(shí)驗(yàn))、細(xì)胞周期、凋亡（流式實(shí)驗(yàn)）、遷移和侵襲(Transwell小室實(shí)驗(yàn))的影響;定量PCR的方法分析RASSF1A對(duì)于骨肉瘤相關(guān)基因MMP7、C-myc、Cyclin D1表達(dá)的影響。通過免疫印跡法分析RASSF1A對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化的影響;最后利用骨肉瘤裸鼠皮下成瘤模型對(duì)RASSF1A的抑癌作用進(jìn)行了初步研究。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建腺病毒穿梭載體pY

4、r-Ads-4-shutter-RASSF1A，并通過腺病毒重組技術(shù)獲得有感染能力的過表達(dá)RASSF1A基因的腺病毒。證明RASSF1A基因在不同來源的骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)有差異，Saos-2及MNNG/HOSC1細(xì)胞系中低表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明RASSF1A基因能夠引起骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOSC1的細(xì)胞G1/S期阻滯、引起細(xì)胞增殖速度降低并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)感染RASSF1A腺病毒的MNNG/HOSC1細(xì)胞與對(duì)照腺病毒細(xì)胞相比，其侵襲、

5、遷移能力也都明顯受到抑制，并且MMP7、C-myc、Cyclin D等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲的關(guān)鍵基因表達(dá)量下調(diào)。細(xì)胞信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞系MNNG/HOSC1中過表達(dá)RASSF1A基因?qū)е耊nt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin的降解和入核蛋白量減少，β-catenin的上游關(guān)鍵蛋白GSK3β磷酸化程度下降，MST1/MST2磷酸化水平上升。裸鼠皮下成瘤模型推測RASSF1A可能抑制腫瘤的生長。<