半乳糖凝集素-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其功能研究.pdf

1、低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)是由氧敏感的α亞基(HIF-1α)和組成型表達(dá)的β亞基(HIF-1β)組成的異二聚體。它是介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。為了進(jìn)一步研究HIF-1α介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而深入解析HIF-1的調(diào)控在生理學(xué)和病理生理學(xué)過(guò)程中的意義，本課題利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，將四環(huán)素撤除誘導(dǎo)表達(dá)HIF-1α的白血病U937T細(xì)胞結(jié)合二維熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)比較

2、HIF-1α表達(dá)與否U937T細(xì)胞中總蛋白表達(dá)譜差異，并通過(guò)基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-TOF)鑒定表達(dá)改變的蛋白。在質(zhì)譜鑒定出的23個(gè)因HIF-1α表達(dá)而改變的蛋白中，通過(guò)Real-time PCR，Western blot，shRNA干擾實(shí)驗(yàn)，熒光報(bào)告素酶(luciferase)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步篩選，我們發(fā)現(xiàn)3個(gè)HIF-1α的新的靶基因：巨噬細(xì)胞加帽蛋白(CapG)，S100鈣結(jié)合蛋白A4(S100A

3、4)和半乳糖凝集素-1(Galectin-1)，并定位了這三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域的HIF-1α的結(jié)合元件(HRE)，而通過(guò)染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α蛋白確實(shí)能直接有效的結(jié)合在這些HRE上。
　　 因?yàn)樵谌齻€(gè)新發(fā)現(xiàn)的HIF-1α靶基因中Galectin-1的變化最為顯著，因此我們進(jìn)一步探究了Galectin-1在HIF-1介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移和白血病細(xì)胞分化中的作用。
　　 首先，通過(guò)特異性shRNA干擾

4、Galectin-1表達(dá)明顯減少了低氧誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而異位表達(dá)Galectin-1能有效回復(fù)因干擾HIF-1α表達(dá)而抑制的SW620細(xì)胞低氧下的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。提示Galectin-1參與了低氧下HIF-1介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 其次，我們發(fā)現(xiàn)在U937T細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)CCAAT/加強(qiáng)因子結(jié)合蛋白-α(CCAAT/enhancer binding protein-α，C/EBPα)也可以顯著增加Ga

5、lectin-1的表達(dá)，并且干擾C/EBPα的表達(dá)可以明顯抑制HIF-1α誘導(dǎo)的Galectin-1上調(diào)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明HIF-1α和C/EBPα對(duì)Galecitn-1啟動(dòng)子具有協(xié)同調(diào)控作用。形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表面分化抗原的檢測(cè)提示，用shRNA干擾Galectin-1的表達(dá)能部分抑制HIF-1α或C/EBPα誘導(dǎo)的LD37T細(xì)胞分化。隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α或C/EBPα誘導(dǎo)AML分化過(guò)程中Galectin-1分泌增加，并且其糖識(shí)