捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素生物學(xué)功能研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)屬毛圓科(Trichostron~vlidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲，分布較廣，寄生于反芻動(dòng)物第四胃和小腸，因吸血可導(dǎo)致貧血和衰弱，引起幼齡動(dòng)物，尤其是羔羊死亡，對(duì)畜牧業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。 凝集素在植物中的研究已有一百多年的歷史，但在線蟲中的研究相對(duì)較晚，尤其是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素(galectin)的研究只有十幾年的時(shí)間。1994年，Smith從捻轉(zhuǎn)

2、血矛線蟲腸道粘膜分離到一種糖蛋白復(fù)合物——H-gal-GP，用其免疫羔羊然后攻蟲，發(fā)現(xiàn)蟲卵排出減少>90％，成蟲減少>70％，是一種很好的疫苗候選抗原。此后，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的galectin基因不斷被克隆和鑒定，作為疫苗的候選抗原也逐漸受到關(guān)注。此前，我們實(shí)驗(yàn)室分別從雌性、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)克隆到了Hco-gal-f(Acc．no．．AY253331)和．Hco-gal-m(Ace．no．AY253330)兩個(gè)完整的galectins編

3、碼序列，并分別表達(dá)了它們。在此研究基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了以下工作： 1．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins對(duì)山羊外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用以體外試驗(yàn)觀察雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組半乳糖結(jié)合凝集素(rHco-gal-m/f)蛋白對(duì)山羊外周血淋巴細(xì)胞多種細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響及其量效關(guān)系。選用2歲健康山羊5只，分別從頸靜脈無(wú)菌采血，分離外周血淋巴細(xì)胞，以ConA或：LPS刺激細(xì)胞的同時(shí)分別加入Oμg/mml、10

4、μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的rHco-gal-m/f進(jìn)行體外培養(yǎng)。用RT-PCR方法，以β-actin作內(nèi)標(biāo)，定量分析淋巴細(xì)胞中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的rnRNA豐度。結(jié)果顯示，雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組半乳糖結(jié)合凝集素(rHco-gal-m)可以抑制上述細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，并呈現(xiàn)出明顯的劑

5、量依賴性；雌性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組半乳糖結(jié)合凝集素(rHco-gal-f)可抑制IL-1β、 IL-4、 IFN-γand TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄，也呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性．結(jié)果表明重組的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酬ectins能降低多種細(xì)胞因子在體外的轉(zhuǎn)錄． 2．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins誘導(dǎo)山羊淋巴細(xì)胞凋亡的作用為了探討雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組半乳糖結(jié)合凝集素(rHco-gal-m/f)誘導(dǎo)天然宿主山羊外周血淋巴細(xì)胞凋亡的作用，

6、采用電鏡觀察、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測(cè)了對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，電鏡下可見大量的細(xì)胞核固縮、碎裂，染色體被染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色，染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)典型凋亡小體的凋亡細(xì)胞；DNA凝膠電泳可見典型的梯形條帶；流式細(xì)胞術(shù)定量分析發(fā)現(xiàn)rHco-gal-m/f誘導(dǎo)山羊外周血淋巴細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。 3．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins抗凝血作用為了研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins蛋白的

7、抗凝血作用，應(yīng)用試管法觀察了該重組galectin蛋白對(duì)8只山羊凝血時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，雄、雌性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galeCtin蛋白均有相似的抗凝血活性，能顯著延長(zhǎng)山羊血液的凝血時(shí)間(P<0.01，P<0.01)；隨著蛋白濃度的增加，抗凝血作用也逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectin蛋白具有一定的抗凝血作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究． 4．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins的免疫保護(hù)性試驗(yàn)使用雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組ga

8、lcctin蛋白，對(duì)9-10月齡山羊做了免疫保護(hù)性試驗(yàn)。健康山羊16只，隨機(jī)分成4組，每組4只。第一組每次免疫10mg rHco-gal-m/f(5mg rHco-gal-m和5mg rHco-gal-f)，第二組每次免疫5mg rHco-gal-m/f(2.5mg rHco-gal-m和2.5mg rHco-gal-f)，同時(shí)設(shè)立不攻蟲對(duì)照組和攻蟲對(duì)照組。第一次免疫使用弗氏完全佐劑和重組抗原混合乳化，第二次免疫使用弗氏不完全佐劑和重組

9、抗原混合乳化，在試驗(yàn)山羊的背部皮下多點(diǎn)注射免疫，兩個(gè)對(duì)照組用1ml PBS代替重組抗原，共免疫兩次，間隔2周．10mg免疫組，5mg免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊于第二次免疫14天后口腔接種5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期感染性幼蟲。從攻蟲后第22至34天，每隔一天采集糞便，蟲卵計(jì)數(shù)．攻蟲后35天，屠宰山羊，剖解皺胃，分離雌雄蟲體，分別計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，10mg免疫組與攻蟲對(duì)照組相比，山羊蟲卵排出減少37.25％(P<0.05)，荷蟲數(shù)

10、減少41.1％(P<0.05)；5mg免疫組，山羊蟲卵排出減少48.03％(P<0.01)，荷蟲數(shù)減少46.19％(P<0.01)。說(shuō)明重組galectin蛋白對(duì)山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染有部分的免疫保護(hù)效果。 5．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins誘導(dǎo)的血清與局部抗體反應(yīng)使用雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galeetin蛋白，對(duì)9-10月齡山羊做免疫保護(hù)性試驗(yàn)的同時(shí)，使用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，測(cè)定了所有試驗(yàn)山羊血清特異

11、性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA濃度以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中IgA濃度。結(jié)果顯示，攻蟲前，10mg和5mg免疫組山羊血清特異性rHco-gal-m/fg體IgG滴度均極顯著地高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01)和攻蟲對(duì)照組(P<0.01)：兩個(gè)免疫組的血清lgA水平有所升高。攻蟲后，10mg和5mg免疫組血清特異性rHco-gal-m/f抗體IgG滴度極顯著地高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01)和攻蟲對(duì)照組(P<0.01)；10mg、

12、5mg免疫組和攻蟲對(duì)照組的血清IgA水平明顯高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。兩個(gè)免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊的胃粘膜表面IgA濃度明顯高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。10mg和5mg免疫組山羊的胃粘膜組織勻漿IgA濃度顯著高于攻蟲對(duì)照組(P<0.05，P<0.05)。此外，10mg和5mg免疫組之間的血清特異性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA濃度以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中IgA

13、濃度差異均不顯著。特異性rHcD-gal-m/f抗體IgG水平與山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲荷蟲數(shù)之間呈顯著的負(fù)相關(guān)性關(guān)系(r=-0.657，P<0.05)；胃粘膜組織勻漿IgA濃度與山羊荷蟲數(shù)之間呈顯著的負(fù)相關(guān)性關(guān)系(r=-0.692；P<0.05)。說(shuō)明特異性rHco-gal-m/f抗體IgG水平和胃粘膜組織勻漿中的IgA水平在抵抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的過(guò)程中可能起到重要的作用。 6．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectins誘導(dǎo)山羊的CD4<'

14、+>、CDS<'+>T和B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答為了探索山羊獲得性免疫保護(hù)機(jī)理，使用雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galectin蛋白免疫山羊后，利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了所有試驗(yàn)山羊外周血中CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞所占比例。結(jié)果顯示，攻蟲前，10mg免疫組CD4<'+>T淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01)；10mg免疫組CD8<'+>T淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01)；5mg和10mg免疫組的

15、B淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.05，P<0.05)。攻蟲后，10mg、5mg免疫組和攻蟲對(duì)照組CD4<'+>T淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.05，P<0.05，P<0.05)：攻蟲對(duì)照組的CD8<'+>T淋巴細(xì)胞水平明顯高于10mg免疫組(P<0.01)；攻蟲對(duì)照組的B淋巴細(xì)胞顯著高于5mg和10mg免疫組(P<0.01，P<0.01)。此外，10mg和5mg免疫組之間的CD4<'+>、CD8<'+>T和B淋巴

16、細(xì)胞水平差異均不顯著。山羊的B淋巴細(xì)胞水平與山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲荷蟲數(shù)之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.587，P<0.05)。 7．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組gaiectins誘導(dǎo)山羊的外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞免疫應(yīng)答雌、雄性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組galeetin蛋白免疫山羊后，對(duì)所有試驗(yàn)山羊的外周血中嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血紅蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，攻蟲前，10mg和5mg免疫組山羊的嗜酸性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)

17、照組(P<0.01，P<0.01)；10mg免疫組山羊的嗜中性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01)；10mg和5mg免疫組山羊的單核細(xì)胞水平逐漸上升；各組山羊的血紅蛋白濃度沒有明顯差異。攻蟲后，10mg、5mg免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊嗜酸性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)照組(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；10mg免疫組的嗜中性粒細(xì)胞濃度明顯高于攻蟲對(duì)照組(P<0.05)；5mg免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊的單核細(xì)胞濃度明顯高