microRNA-150在膽管細(xì)胞性肝癌患者中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、膽管細(xì)胞性肝癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是繼肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）后第二種常見的原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC），又稱肝內(nèi)膽管癌。ICC占原發(fā)性肝癌發(fā)病率的10～15％，研究表明，近數(shù)十年來其發(fā)病率和死亡率在中國乃至世界范圍內(nèi)迅速增長，是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤之一。ICC發(fā)病隱匿，缺乏特異性臨床癥狀和體征

2、，也沒有特異性好、靈敏度高的實驗室標(biāo)記物可以用于早期診斷，病情進展快，大部分患者在首次就診時已經(jīng)處于疾病進展期，從而喪失了接受手術(shù)治療的最佳時機，預(yù)后極差；而極少數(shù)患者，在首次就診時尚處于早期，積極接受規(guī)范化治療，從而可以獲得相對較好的預(yù)后。因此，探索ICC有效的早期診斷及治療方式對改善ICC患者生存預(yù)后不可或缺。時至今日，用于診斷ICC的腫瘤分子標(biāo)記物已經(jīng)達(dá)到十余種，但是這些標(biāo)記物都存在靈敏度低或是特異度不足等問題，不能有效地用于早期

3、診斷。改善 ICC患者預(yù)后的關(guān)鍵在于早期診斷，而早期診斷 ICC的關(guān)鍵在于高效的特異的篩查診斷手段，尋找準(zhǔn)確性高、靈敏度好、特異度高的標(biāo)記物在臨床研究中顯得尤為重要。
　　MicroRNAs（miRNAs）是近年來人們發(fā)現(xiàn)的一類小的非編碼 RNA分子，通過與靶基因mRNA3’末端非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）的堿基配對結(jié)合而抑制靶基因的翻譯表達(dá)。miRN A廣泛參與人體的生長、發(fā)育等各個階段，它

4、的異常表達(dá)與多種良惡性疾病的發(fā)生發(fā)展進程密不可分。在生物體內(nèi)miRN A既可以扮演癌基因角色，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展等；也可以扮演抑癌基因角色，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等。不同種類的腫瘤中miRN A的表達(dá)水平具有顯著的差異性，并且能夠穩(wěn)定地被檢測，因此在未來的生命科學(xué)研究中將miRN A作為新型標(biāo)志物是很有希望的。
　　本課題采用miRNA芯片檢測、RT-qPCR分析、ROC曲線評價等研究方法，期望找到可以用于ICC診斷的特異性miRNA。

5、本課題主要包含以下四個研究部分：
　　第一部分、收集整理病歷及標(biāo)本資料，選擇入組患者
　　方法：運用數(shù)據(jù)錄入管理軟件Epidata3.1完善肝癌患者病歷資料數(shù)據(jù)庫，依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)收集入組的膽管細(xì)胞性肝癌患者及對照者的臨床指標(biāo)；運用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS21.0檢測兩組患者臨床指標(biāo)的均衡性。
　　結(jié)果：膽管細(xì)胞性肝癌組患者血清ALB值為40.9g/L±4.30g/L，明顯低于對照組平均血清ALB值44.9g/L±3.84g

6、/L，其組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010）；而轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等其它臨床指標(biāo)間的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：白蛋白在肝臟合成，是評定機體營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)。慢性消耗性疾病如惡性腫瘤，白蛋白會有所降低。實驗組和對照者組間的臨床指標(biāo)相似，一致性較好，具有可比性。
　　第二部分、建立膽管細(xì)胞性肝癌miRNA表達(dá)譜，選擇目標(biāo)基因miRNA-150
　　方法：采用miRN A芯片檢測技術(shù)，建立膽管細(xì)胞性肝癌的miRN

7、A表達(dá)譜，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析與文獻研究后選擇進一步研究的目標(biāo)基因。
　　結(jié)果：miRNA芯片檢測顯示，膽管細(xì)胞性肝癌患者癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)的miRNA有：miR-150、miR-638、miR-4459、miR-4530及miR-378c，而表達(dá)量明顯增高的miRNA有：miRNA-660、miR-425、miR-93、miR-494以及miRNA-574。經(jīng)研究文獻并討論后，最終選擇miRNA-150為后續(xù)研究的目標(biāo)基因。

8、>　　結(jié)論：本部分實驗通過miRN A芯片所獲得的膽管細(xì)胞性肝癌的miRN A表達(dá)譜與既往研究發(fā)現(xiàn)的表達(dá)譜不完全一致。個體樣本間的異質(zhì)性可能是出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因。同時也說明了膽管細(xì)胞性肝癌的發(fā)生發(fā)展具有復(fù)雜性和多樣性，涉及多個基因參與并調(diào)控。miRNA-150在膽管細(xì)胞性肝癌中的作用尚無相關(guān)研究報道，選擇miRNA-150作為進一步研究的目標(biāo)基因符合該課題的研究目的，具備可行性。
　　第三部分、運用RT-qPCR檢測組織與血漿

9、標(biāo)本miRNA-150表達(dá)水平
　　方法：對于癌組織及癌旁組織標(biāo)本采用miRNeasy? Mini試劑盒提取總RNA；對于血漿標(biāo)本采用RN24-BLOODmisi試劑盒提取總RNA。采用分光光度計檢測得到的總RNA溶液的純度與濃度，運用RT-qPCR技術(shù)檢測標(biāo)本中miRNA-150的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與癌旁組織標(biāo)本相比，miRNA-150在膽管細(xì)胞性肝癌癌組織標(biāo)本中表達(dá)水平顯著降低；與對照者的血漿標(biāo)本相比，miRNA-1

10、50在ICC患者血漿中表達(dá)明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：miRNA-150在ICC患者癌組織中下調(diào)表達(dá)，然而在其血漿中上調(diào)表達(dá)。也有研究報道m(xù)iRNA-150在其他腫瘤組織中上調(diào)或是下調(diào)表達(dá)，因此我們認(rèn)為它在不同腫瘤中具有不同的表達(dá)譜，其異常表達(dá)是惡性腫瘤中的普遍現(xiàn)象。對于其在組織及血液中相反的表達(dá)結(jié)果，分析認(rèn)為miRNA-150在ICC中可能扮演著抑癌基因角色，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用使得血液中miRNA-150表達(dá)水平增高。
　　第

11、四部分、膽管細(xì)胞性肝癌患者血漿miRNA-150的臨床意義分析
　　方法：以15例膽管細(xì)胞性肝癌患者血漿miRNA-150的表達(dá)水平及其各項臨床指標(biāo)為基礎(chǔ)，使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0分析miRNA-150的臨床意義，當(dāng)P值小于0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：血漿 miRNA-150可以用來作為診斷膽管細(xì)胞性肝癌的分子標(biāo)志物，當(dāng)miRNA-150與血清CA19-9聯(lián)合應(yīng)用時，診斷的靈敏度及特異度分別可以達(dá)到8

12、0%和100%、而AUC可以達(dá)到0.920。根據(jù)15例ICC患者血漿mRNA-150的平均表達(dá)量，將血漿中miRNA-150表達(dá)量小于等于-0.507的8名ICC患者歸為低表達(dá)組，將miRNA-150表達(dá)量大于-0.507的7名患者歸為高表達(dá)組。統(tǒng)計分析顯示：膽管細(xì)胞性肝癌患者血漿miRNA-150表達(dá)水平與其腫瘤大小、CA19-9、腫瘤分期以及 GGT等各項臨床指標(biāo)無相關(guān)性。
　　結(jié)論：miRNA-150單獨診斷ICC具有較高的