角膜不同保存方法與術(shù)后免疫排斥反應(yīng)相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、目的： 角膜病是當(dāng)今世界主要的致盲性眼病之一，角膜移植手術(shù)是治療角膜病患者脫盲最有效的方法。眼庫及角膜保存技術(shù)是開展角膜移植的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是目前角膜移植材料來源短缺及各地區(qū)材料分布不均勻，臨床上往往不能滿足角膜移植患者量多和應(yīng)付急診手術(shù)的要求，故對有限移植材料的保存日益受到人們的重視。所以，建立有效的眼庫和深入研究角膜保存方法，延長角膜的生命活力，充分利用有限的角膜材料，隨時為臨床角膜移植提供優(yōu)質(zhì)供體材料是一個重要課題?；诙唐?/p>

2、保存方法對角膜材料保存時間的限制，如果能做到中長期活性材料的保存，將為角膜移植的開展起到關(guān)鍵的作用。角膜移植手術(shù)是治療角膜病致盲的重要手段，術(shù)后角膜排斥反應(yīng)是角膜移植手術(shù)失敗的主要原因。角膜移植排斥反應(yīng)是一個多因素參與，極其復(fù)雜和高度調(diào)節(jié)的過程。有關(guān)角膜移植的排斥反應(yīng)的發(fā)生機制在許多環(huán)節(jié)上尚不清楚。如何將角膜移植的排斥反應(yīng)降到最低限度已經(jīng)成為國內(nèi)外許多眼科學(xué)者的主要研究課題。本試驗通過探索簡易安全的中長期保存供體角膜的方法，采用大鼠角膜

3、行中期保存液和深低溫冷凍長期保存，來評價不同保存方法保存后角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性，研究其使用的可靠性，為臨床能夠提供更為滿意優(yōu)質(zhì)的活性角膜供體材料及應(yīng)用中長期保存材料行穿透性角膜移植奠定基礎(chǔ)；旨在對不同方法保存的角膜行穿透性角膜移植后的觀察，探討角膜保存時間與術(shù)后排斥反應(yīng)的關(guān)系，通過病理和免疫學(xué)方法定性和定量測定細(xì)胞因子和粘附分子(TNF-a和ICAM-1)的含量變化，并分析其原因，為提高角膜移植的成功率減少排斥反應(yīng)的發(fā)生探索新的途徑。

4、 方法： 1、建立簡易中期保存液和微機監(jiān)控程序降溫的深低溫保存法。將30只雌性成年健康清潔級Wistar鼠眼隨機分為3組，應(yīng)用不同保存方法保存大鼠角膜。分別為濕房保存組(Ⅰ組)、中期保存液保存組(Ⅱ組)和深低溫保存組(Ⅲ組)。采用臺盼藍．茜素紅染色對不同保存方法的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進行評價。判定3種不同保存方法的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性狀態(tài)。 2、建立大鼠穿透性角膜移植排斥反應(yīng)動物模型。分別使用不同保存方法的Wistar鼠眼(實驗

5、一Ⅰ組)和角膜片(實驗一Ⅱ組、Ⅲ組)作為供體，成年雌性健康清潔級SD大鼠作為受體，隨機分3組。觀察各組角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)指數(shù)(RI)、植片存活時間(MST)。標(biāo)本行蘇木素．伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察植片的免疫排斥反應(yīng)程度及炎癥程度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測各組大鼠角膜移植術(shù)后10天時房水、血清中腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的含量變化。 結(jié)果： 1、經(jīng)不同方法保存后的各組大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度及活性率

6、相似。使用中期保存液保存組和深低溫保存組后復(fù)溫的角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞密度和活性率與濕房保存組比較差異無顯著性(濕房組細(xì)胞密度2729.5±158.0個/mm<'2>，活性率ESR％為88.9％±3.5％；中期保存液保存組分別為2646.84±217.2個/mm<'2>和86.9％±2.7％；深低溫保存組分別為2706.24±184個/mm<'2>和87.3％±3.3％，P>0.05)。中長期保存角膜只要關(guān)鍵步驟合理，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度并不隨保

7、存時間延長而明顯下降，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性均在85％以上。 2、異體濕房保存組(Ⅰ組)。MST為10.4d±1.70d，異體中期保存液保存組(Ⅱ組)MST為12.9d4±1.81d，異體深低溫保存組(Ⅲ組)MST為16.1d±2.57d。異體深低溫保存組MST明顯延長，與其他兩組比較均有顯著性P<0.01。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組于術(shù)后10d時角膜植片水腫、混濁程度及新生血管范圍依次減輕。角膜移植術(shù)后10d時HE染色顯示Ⅲ組免疫排斥反應(yīng)較

8、輕微，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤和新生血管情況較Ⅰ組、Ⅱ組明顯減輕，Ⅱ組較Ⅰ組明顯減輕。免疫組化染色顯示Ⅲ組ICAM-1表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯減弱。Ⅲ組眶血清及房水中TNF-a含量為(213.76±19.06pg/mL，203.17±16.62 pg/mL)明顯低于Ⅱ組(269.08±14.28 pg/mi，240.87±9.28 pg/mL)和Ⅰ組(336.51±38.50 pg/mL，284.83±28.76 pg/mL)，差異有顯著性P