紫杉二烯合成酶及腫瘤血管生成抑制因子基因克隆與轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的第二大殺手，尋找對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高殺傷力而對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小的新型抗腫瘤藥物，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜類(lèi)化合物赤霉素的代謝途徑構(gòu)建能夠表達(dá)生產(chǎn)紫杉醇前體的重組赤霉菌，為20世紀(jì)人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的最重要的新型抗癌藥物二萜類(lèi)化合物紫杉醇開(kāi)辟新的藥源途徑，為緩解藥源短缺對(duì)紫杉醇應(yīng)用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大造成的嚴(yán)重限制提供理論和技術(shù)依據(jù)；另一方面，為新一代抗腫瘤活性分子腫瘤血管生成抑制因子Arr

2、esten尋找安全、有效、廉價(jià)、易于推廣應(yīng)用的蛋白表達(dá)生產(chǎn)系統(tǒng)。 Ⅰ采用RT-PCR方法從紅豆杉胚性愈傷組織細(xì)胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全長(zhǎng)cDNA。將可以在大腸桿菌BL21s中表達(dá)、序列正確的紫杉二烯合成酶基因全長(zhǎng)cDNA引入表達(dá)載體pAN52-1Not的起始密碼子ATG下游，并將選擇標(biāo)記潮霉素B抗性表達(dá)框引入pAN52-1Not完整轉(zhuǎn)錄單位的側(cè)翼區(qū)域，獲得紫杉二烯合成酶基因cDNA表達(dá)載體pANts-hyg。

3、 Ⅱ采用PCR擴(kuò)增法從赤霉菌基因組中克隆了赤霉素生物合成途徑中第一個(gè)特異性關(guān)鍵酶——內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶基因cps的部分序列作為同源片斷，以平端連接的方式引入絲狀真菌表達(dá)載體pCSN44的HindⅢ位點(diǎn)，獲得旨在中斷赤霉素生物合成途徑的cps基因打靶載體pCSNcps。 Ⅲ通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)建立了本實(shí)驗(yàn)用赤霉菌菌株原生質(zhì)體制備方法。研究結(jié)果表明，以10ml含15％粗制崩潰酶的酶解體系于37℃酶解4h，6個(gè)實(shí)驗(yàn)用赤霉菌受試菌株的原生質(zhì)

4、體產(chǎn)量都可以達(dá)到106/mL，能夠滿足遺傳轉(zhuǎn)化操作的需要，而使用溶壁酶制備實(shí)驗(yàn)用赤霉菌菌株原生質(zhì)體的產(chǎn)量不足103/mL。 Ⅳ建立了適用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生質(zhì)體/PEG法轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)原生質(zhì)體/PEG轉(zhuǎn)化法獲得少量赤霉菌轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)及Southernblot雜交檢測(cè)，證實(shí)本研究采用原生質(zhì)體/PEG法以pANts-hyg轉(zhuǎn)化獲得一株基因組整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌轉(zhuǎn)化子和4株pCSNcps轉(zhuǎn)

5、化、潮霉素B抗性水平高于親本菌株的赤霉菌轉(zhuǎn)化子。整合有外源基因的赤霉菌轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)形態(tài)和生長(zhǎng)能力與親本菌株相比存在顯著差異。而且，隨著傳代次數(shù)的增加，生長(zhǎng)能力明顯下降；用cps基因打靶載體pCSNcps轉(zhuǎn)化赤霉菌的研究結(jié)果表明，簡(jiǎn)單的插入型打靶載體，即使攜帶足夠長(zhǎng)的同源序列，也不利于通過(guò)同源重組方式破壞靶基因cps而致使赤霉素合成中斷的赤霉菌轉(zhuǎn)化子的獲得。 Ⅴ考查了電擊轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)于實(shí)現(xiàn)赤霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的有效性。研究結(jié)果初

6、步表明，不同的赤霉菌菌株，其轉(zhuǎn)化性能差異很大；電擊轉(zhuǎn)化法對(duì)提高赤霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率沒(méi)有明顯效果；采用基因槍法轉(zhuǎn)化赤霉菌菌絲斷片也未獲得比原生質(zhì)體/PEG法更好的結(jié)果。 Ⅵ采用一步法RT-PCR從人胎盤(pán)組織中擴(kuò)增出讀碼框架大小為690bp的腫瘤血管生成抑制因子ArrestencDNA。經(jīng)亞克隆引入植物雙元表達(dá)載pCAMBIA1301的NcoⅠ和BstEⅡ位點(diǎn)之間，獲得目的基因植物表達(dá)載體pCAMBIAarr并通過(guò)凍融法將pCAM

7、BIAarr轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得攜帶目的基因的重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pCAMBIAarr)。 Ⅶ采用葉盤(pán)法以重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pCAMBIAarr)轉(zhuǎn)化煙草秦?zé)?5，經(jīng)過(guò)潮霉素B篩選、PCR及Southenblot雜交檢測(cè)，獲得2個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草再生株，進(jìn)一步的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中存在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。該結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了選擇標(biāo)記的有效性和表達(dá)載體在宿主植物中的可用性，為進(jìn)