基于DNA芯片技術(shù)鼠疫耶爾森氏菌在不同條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、背景：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)引起的一種烈性傳染病，其流行給人類帶來了巨大的災(zāi)難。鏈霉素、四環(huán)素與氯霉素為治療鼠疫的首選藥物。抗生素的使用，使這種致死性疾病得到了有效控制。自然疫源地的存在、動物間鼠疫的流行、不斷爆發(fā)的人間鼠疫以及多重耐藥株的出現(xiàn)，迫使不得不重新面對這種古老的疾病。 鼠疫菌在體內(nèi)致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是在巨噬細胞內(nèi)的生存繁殖，該菌與巨噬細胞相互作用后的轉(zhuǎn)錄組研究是揭示其體內(nèi)生存的機制和細胞反應(yīng)機制的重要依

2、據(jù)。本研究室已經(jīng)開展了鼠疫菌對溫度轉(zhuǎn)換、低鎂離子、低鐵離子、低pH、高鹽、高滲、冷熱休克、H202、抗菌肽等環(huán)境條件下的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。針對鼠疫菌侵入機體后，還會遇到營養(yǎng)缺乏的環(huán)境因素刺激，對鼠疫菌進行了體外模擬不同營養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)錄譜研究；并對鼠疫菌與小鼠腹腔巨噬細胞在體內(nèi)相互作用后各自的轉(zhuǎn)錄譜進行了研究。通過綜合分析體外模擬巨噬細胞內(nèi)各種脅迫條件的轉(zhuǎn)錄譜與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜，為揭示鼠疫菌在胞內(nèi)生存的機制奠定了基礎(chǔ)。 方法：本研究應(yīng)用鼠

3、疫菌全基因組DNA芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)，研究了鼠疫菌在10xMIC鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素的藥物濃度作用30min下的轉(zhuǎn)錄譜；高營養(yǎng)BHI培養(yǎng)基與低營養(yǎng)TMH培養(yǎng)基中對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)錄譜；對數(shù)生長期與穩(wěn)定期不同營養(yǎng)培養(yǎng)基中鼠疫菌的轉(zhuǎn)錄譜；體內(nèi)鼠疫菌與小鼠腹腔巨噬細胞相互作用30rain后鼠疫菌的轉(zhuǎn)錄譜以及小鼠腹腔巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄譜。應(yīng)用實時定量RT-PCR對鏈霉素作用轉(zhuǎn)錄譜的結(jié)果進行了驗證，應(yīng)用Cluster軟件對不同條件下鼠疫菌的轉(zhuǎn)錄譜結(jié)

4、果進行了聚類分析。 結(jié)果：RT-PCR驗證了轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的可靠。鏈霉素、氯霉素以及四環(huán)素作用的差異基因345、712和177個，獲得了三種抗生素作用于鼠疫菌的主要影響基因，通過聚類分析對三種不同抗生素的分子作用機理進行了認識。不同營養(yǎng)條件下對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的差異基因分別為246個和76個，對數(shù)生長期與穩(wěn)定生長期在不同營養(yǎng)環(huán)境中差異基因分別為244個與251個，獲得了鼠疫菌在不同生長時期與營養(yǎng)環(huán)境下的基因轉(zhuǎn)錄特點，并對產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄

5、特點的分子機理進行了分析，發(fā)現(xiàn)了鼠疫毒力相關(guān)基因在低營養(yǎng)環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄特點。在體內(nèi)鼠疫菌與巨噬細胞相互作用30分鐘后鼠疫菌與小鼠腹腔巨噬細胞的差異基因為534個和59個。細菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的結(jié)果表明，在感染早期，鼠疫菌T3SS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，表明該系統(tǒng)在鼠疫菌致病過程中的重要作用。通過鼠疫菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜與體外條件轉(zhuǎn)錄譜的聚類綜合分析，初步獲得一些與病原體在體內(nèi)生長相關(guān)的基因及與致病性密切相關(guān)的毒力基因。 結(jié)論：通過研究共獲得鼠疫

6、菌在不同條件下的8個標識轉(zhuǎn)錄譜和一個小鼠巨噬細胞在體內(nèi)與感染鼠疫菌相互作用的標識轉(zhuǎn)錄譜，從分子水平揭示了鼠疫菌在不同藥物作用、不同生長階段與不同營養(yǎng)條件以及在體內(nèi)與巨噬細胞相互作用的不同轉(zhuǎn)錄特征。鼠疫菌與巨噬細胞相互作用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的完成，為揭示鼠疫菌感染巨噬細胞機理提供了一種可能；為全面解析體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄譜架起了一座橋梁。通過體外轉(zhuǎn)錄譜與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的綜合分析可以深入的認識鼠疫菌與巨噬細胞相互作用的分子作用機理。初步了解鼠疫菌突破巨噬細胞防線